等电聚焦和二维凝胶电泳实验（二）
SDS-PAGE
Laemmli(1970) 描述的 SDS-PAGE 在很长一段时间内作为各种生化分析中分辨完整蛋白质的备选方法。这主要是因为对于疏水性很强的蛋白质,SDS 是最好的增溶去污剂，所有的蛋白质，包括碱性很强的蛋白质，都向同一方向移动, 分离取决于各自的表观分子质量 (通常称为分子质量）。
1.分离原理
当将过量的 SDS 加入到蛋白质溶液中时，蛋白质会形成一些阴离子微粒，其每个质量单位带一个恒定的净负电荷。蛋白质的三级结构和二级结构被破坏，肽链被解开。为了使肽链完全展开，需要使用诸如 2_巯基乙醇或二硫苏糖醇等还原剂把半胱氨酸之间的二硫键打开。Ibel 等 (1990) 认为, 这些复合物的多肽表面部分被覆盖，部分被打开，犹如项链一般。在电泳过程中所有的 SDS 微粒都移向正极, 其电泳迁移率主要取决于分子质量，但也会受蛋白质疏水性的影响。如果将蛋白质的迁移距离对表观分子质量的对数作图，就会得到一条在线性范围内的 S 形曲线。在共迁移的蛋白质分子质量标准的辅助下，就可以估算多肽的分子质量。
2.胶的类型
一般来讲，SD&PAGE 可以在各种各样的基础缓冲体系中进行；但是，LaemmIi(1970) 创立的不连续缓冲体系是最常用的体系, 在胶中使用 PH8.8 的 Tris-HCl, 在电泳缓冲液使用 SDS^Tris-甘氨酸。对于一维分离，pH6.8 的低浓度积层胶使样品缓慢进入胶内，而不发生聚集，而且在分离起始时有压缩条带的效果。但是, 在二维凝胶电泳中通常不使用积层胶，因为蛋白质已被预分离，而且已经在 3 mm 宽的 IPG 胶条内被高效浓缩 (详见本章 3.6 节)。
标准的基质是含有 12.5%T(全部为丙稀酰胺) 和 2.6%C(用于交联的双丙烯酰胺) 的均一胶层。但一些应用中对于确定的范围需要精确分离。例如，对于高分子质量蛋白质需要更低的％T; 而对于低分子质量蛋白质，更高的会有更好的解析度, 所以浓度要提高。梯度 SDS-聚丙烯酰胺凝胶可以提供更大动态范围的分辨率, 但是其灌胶的一致性和可重复性是极大的挑战，但这些要求对于使用二维凝胶的定量蛋白质组学是至关重要的。多孔梯度凝胶显示出更宽的分子质量线性范围, 并且可提高一些较难解析的蛋白质的分辨率, 如糖蛋白。
SDS 电泳可在夹在玻璃板中的盒式垂直装置中运行，也可在水平平面上进行。胶的厚度为 1.5~ 0.5 min。较厚的凝胶在力学上更加稳定，但是更难染色，而且会产生额外的样品损失，对随后的质谱分析也会产生额外的背景噪声。较薄的凝胶更易有效地冷却，因此电泳可以进行得更快从而有更好的分辨率。
相对于过去几十年中二维凝胶流程取得的进展，二维 SD&PAGE 分离几乎没有什么变化。垂直电泳系统的使用更普遍，同时跑 1 块或 12 块甚至更多块胶的设备也已经出现。在历史上水平平板装置也是可行的, 而且因其低试剂消耗量 (如 SDS 电泳缓冲液）、样品的处理方法以及较短电泳时间带来的提高分辨率的潜力，现在有复兴的迹象。一些进展包括: 使用有弹性的塑料支持物 [包括用于差异凝胶电泳 (DIGE) 和其他基于荧光的技术的弱荧光介质], 用于同时灌制多块可重复的丙烯酰胺梯度和不同丙烯酰胺配方的凝胶的特别装置，以增加凝胶的保质期和耐用性。
碱性 pH 梯度分辨率的提高
相对于酸性 pH 梯度, 碱性 pH 梯度的高分辨率等点聚焦更具有挑战性，这既是由于阴极漂移的作用，又是由于维持蛋白质可溶性的还原剂的丢失（DTT 是弱酸, 在 pH 大于 8 时带电，因此会与梯度的碱性区域分离）。阴极漂移作用最早通过引人非平衡 pH 梯度电泳 (NEpHGE) 得到解决 (OFarrelletal.,1977)。但是在 pH 大于 8 时还原剂丢失的问题仍然存在，而且由于半胱氨酸不再受到保护，导致多肽与尿素发生非特异反应、肽段背向折叠 (backfolding) 和聚集，造成二维凝胶碱性区域中蛋白质点的伪迹 (artifact) 和水平拖尾（streaking)。
用膦类化合物，如 TBP 或 TCEP 替换巯基试剂可以部分防止这类效应，但是由于这些试剂在电场中不稳定，会产生额外的伪迹。在等电聚焦之前，用碘乙酰胺、乙烯基吡啶或单体丙烯酰胺预先将蛋白质烷基化，都会因多肽烷基化不完全及等电点的变化而产生额外的伪迹。
过量使用羟乙基二硫醚（hydroxyethyldisulphide,HED)[商品化后商品名为 DeStreak(GEHealthcare)] 提供了 pH 下保持疏基处于还原状态（通过质量作用）的方法，显著提高了使用 IPG 胶条的碱性等点聚焦电泳的分辨率 (Olssonetal.,2002)。特别是在阳极样品人口联合使用上样杯上样或纸桥上样时效果更佳，因为上样时碱性蛋白质都带着相同的酸性电荷进入梯度胶条，然后向阴极移动从而达到等电点 (而不是令它们向两个方向都移动）。
当蛋白质进入到 IPG 胶条时，半胱氨酸侧链上的巯基会立即被氧化成高度稳定的二硫化物混合物。这是一种高特异性的，可以阻止不需要的副反应的平衡反应（图 30.4)。
使用 DeStreak 方法制备样品时可以采用小量的 DTT，那么蛋白质便可在聚焦前保持还原状态。然而需要注意的是，过量的 DTT 会将 HED 还原成 2-巯基乙醇, 这会导致更多拖尾①。
差异凝肢电泳
即便 IPG 胶条重复性越来越高，样品制备和电泳条件更加严格，凝胶之间还是存在差异。差异表达蛋白质组实验的成功依靠对单独采集 (生物学上的) 样本的重复的测量，同样也需要技术上的重复 (对同一生物样本的重复测量）以控制分析中产生的差异，如样品采集、处理和凝胶之间的变化。通过运用 DIGE 技术 (FriedmanandLilley,2009;LilleyandFriedman，2004;Unluetal.,1997) 可以解决这些方面的挑战。
1.染色和检测
近来，二维凝胶电泳所用的荧光染料在发展和应用上获得了重大进步。这些染料用于检测和定量溶解在凝胶中的完整蛋白质种类。荧光染料特别提供了检测的敏感性，其敏感程度至少大于等于银染法（约 Ing)，并且还将丰度的线性动态范围极大地提高了 3~4 个数量级 (银染和考马斯亮蓝 R-250 染色法通常提供低于 1 个数量级的动态范围）。
2.DIGE 和定量分析算法
1997 年，DIGE 法开始使用 (Unluetal.，1997)，此法将混合样品的荧光标记的动态范围与灵敏度应用于同一块胶中，排除了共分析样本中的分析性偏差 (几种凝胶之间的）。
现在这一方法也能在一系列 DIGE 胶中应用，利用混合的样本内对照，使迁移模式配准成为可能，从而标准化丰度比（abundanceratio)，为多变量实验提供了非凡的统计支撑 (KarpandLilley，2005)。
简而言之，这一方法要求事先用光谱区别明显的荧光染料 (Cy2、Cy3 和 Cy5) 标记多种样本，然后将样本混合并在同一二维凝胶中分析。这一方法能排除几种凝胶之间的偏差，并且相互独立的突光影像也能被单独记录，用于单个分辨特征 (resolvedfeature) 中的蛋白质丰度变化的直接定量（图 30.5)。这里用到了两种不同的标记概念:「最少量」标记，即将占蛋白质总量约 5% 的赖氨酸中的 e-氨基进行标记广充分」标记，即将蛋白质混合物中所有可标记的半胱氨酸「充分饱和」地进行标记。
在一系列含有不同的由 Cy3 或 Cy5 标记的凝胶中分析用 Cy2 标记的内参照时，DIGE 法最见成效，并有统计依据。重要的一点是，该 Cy2 标记的内参照是由实验中所有样本等量混合而成，并在多凝胶实验的每一块凝胶中都存在。由于个体样本（由 Cy3 或 Cy5 标记) 与等份的 Cy2 基准混合物相混合，每种分辨特征 (resolvedfeature) 便可直接与凝胶中 Cy2 基准混合物中的同源特性（cognatefeature) 联系起来。凝胶中的 Cy3:Cy2 与 Cy5:Cy2 之间的各种比例便能在不受几种凝胶之间偏差的干扰之下算得，这些比例可用于实验中另一些样本中这一特性的所有其他衡量标准，不但技术性 (分析性) 误差极小，而且有着强有力的统计学功效 (KarpandLilley,2005)。
DIGE 法也直接适用于多变量统计分析之中，如主成分分析和系统聚类。这些附加的统计工具能够有效地帮助人们发现一组实验样本中的差异。重要的是，还能帮助确定差异中的主因素是否能够描述生物性，或者能够揭示样本之间未曾预料到的 (或是在准备样本时被带入的) 差异，或者能够精准定位出能对实验刺激或分类作出集体反应的蛋白质亚群 [如见 Franco 等（2009);Friedman 等（2006;2007);Hatakeyama 等（2006);Suehara 等 (2006)。综述见 Friedman 和 Lilley(2009);Lilley 和 Friedman(2004)]。
3.软件分析工具
现在，一些软件程序能辅助完成二维凝胶实验 (无论是 DIGE 还是其他) 的定量分析。
这些程序最大的区别，便是在探测蛋白质特性 (界线）和几种凝胶之间校准（aliSnment)/配准 (registration)(如基于载体的图像变形）时的算法有所不同。总体而言，这些程序都提供了强有力的伴有单变量 (如 f 分布检验和方差分析) 和多变量 (如主成分分析和系统聚类）的统计分析的分析工具, 非常利于估量个体蛋白质特性和整体表达模式的丰度变化，该类模式能够将描述生物学表型的变化和那些在实验中未预料的偏差辨别区分。
