免疫组织/细胞化学染色-1
一 基本原理
免疫组织/细胞化学是利用抗原抗体具有高度特异性结合反应的原理，采用已知抗体检测组织或细胞的抗原物质，然后以适当的方式显示其结合信号以证明组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。
二 基本步骤
1 三步法：以SP（链霉卵白素-过氧化物酶）试剂盒为例：
石蜡切片脱蜡至水。
蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3% H2O2室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，5min×3次。
5-10% 正常山羊血清封闭，室温孵育10min。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。
PBS冲洗，5min×3次。
滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育10-30min；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10-20min。
PBS冲洗，5min×3次。
滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10-30min；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10-20min。
PBS冲洗，5min×3次。
显色剂显色（DAB或AEC）。
自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片。
2 二步法: 以通用型二步法检测试剂盒为例。
石蜡切片脱蜡至水。
蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3% H2O2室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，5min×3次。
滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。
PBS冲洗，5min×3次。
滴加试剂1（polymer helper）,室温或37℃孵育20min，PBS或TBS冲洗，5min×3次。
滴加试剂2（poly pero×idase-anti-mouse/rabbit IgG），室温或37℃孵育20-30min，PBS或TBS冲洗，5min×3次。
显色剂显色（DAB或AEC）。
自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片。
3 冰冻切片的免疫组化染色步骤：
冰冻切片4-8µm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。
室温放置30min后，入4℃丙酮固定10min。
PBS冲洗，5min×3次。
用过氧化氢孵育5-10min，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗，5min×3次。
以下同石蜡切片免疫组化染色步骤（滴加一抗开始）
三 对照试验设立：
免疫组化染色结果的判断的一个重要因素就是设立阴性和阳性对照片，只有这样才能排除各种因素的干扰而正确评价染色结果。
1 阳性对照：
选择与待测片靶抗原相同，且含中等量抗原，染色前处理过程相一致的切片。所有试剂标准化，染色方法具可靠性，一致性。当阳性片呈阳性结果时，即可初步确定待检片性质。
2 阴性对照：
排除染色过程中非特异染色和交叉反应所造成的假阳性结果。
（1） 空白对照：排除组织细胞自发荧光，或所含生物素，以及内源性酶等物质；
（2） 替代试验：可用待测抗原的特异性抗体的同一动物免疫前血清或同种动物非免疫血清，也可用与靶抗原无关的抗血清；以及用缓冲液（PBS）替代等。
（3） 吸收试验：可用过量已知抗原与抗体在4℃下充分反应，离心后进行免疫组化染色，已知阳性片呈阴性或弱阳性反应。
（4） 抑制试验：多应用间接法，第一步先加非标记抗体，待充分反应后再加同一标记抗体，另一张切片可用正常血清或缓冲液代替非标记抗体。结果前者阴性后者阳性。
