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数据非依赖采集DIA 解决方案（一）

2020.5.18

一、数据非依赖采集（DIA）

随着生命科学的快速发展，蛋白质组学的关注焦点和研究趋势已经逐渐从定性转向定量。定量蛋白质组学是对细胞、组织乃至完整生物体的蛋白质表达量及差异进行分析，对于生物过程机理的探索和临床诊断标志物的发现与验证具有重要意义。

基于静电场轨道阱 Orbitrap 的数据非依赖采集（Data Independent Acquisition, DIA）是赛默飞为用户带来的一项全新的、全息式的质谱技术。DIA 将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息（图 1）。

图 1. DIA 与经典 Shotgun、SRM/MRM 的原理比较

与传统蛋白质组学“鸟枪法”（Shotgun）相比，DIA：(1) 无歧视地获得所有肽段的信息，不会造成低丰度蛋白信息的丢失，(2)循环时间固定，扫描点数均匀，定量准确度高，(3) 肽段的选择没有随机性，数据可以回溯，对于复杂蛋白样本，特别是低丰度蛋白具有更优异的重现性。与传统质谱定量“金标准”选择反应监测/ 多反应监测（SRM/MRM）相比，DIA：(1) 无需提前指定目标肽段，适用于未知蛋白分析；(2) 无需优化方法，获得数据后再基于谱图库实现定性确证和定量离子筛选；(3) 通量无上限，适合大规模蛋白定量分析。

形象地说，Shotgun 就像机枪扫射，高效率地打击尽可能多的目标；SRM/MRM 就像精准狙击，准确无误地打击特定目标；而DIA 就像地毯式轰炸，无遗漏地打击全部目标（图 2）。

图 2. Shotgun、DIA 和 SRM/MRM 的特点比较

DIA 有效结合了 Shotgun 和 SRM/MRM 的优势和特点，为用户带来全新的质谱分析体验，和强大的蛋白质组学定量策略。在临床研究中，高度的复杂性、庞大的样本量、样本的不稳定性是分析的难点，而 DIA 提供条件统一、无差别的质谱采集方法，能够在样本信息“完全未知”的情况下，对样本进行高通量、高速度采集，获得数据之后再进行深入解析和挖掘，是临床蛋白质组学实验的利器。在生物学研究中，多个时间点或多种条件下蛋白表达量的变化趋势是分析的重点，而 DIA 的灵敏度、精确度和重现性为获得准确、可靠的定量结果提供了有力保障。

1. DIA

DIA 通常将 m/z 400–1200 的全扫描范围分割为 25 m/z 的窗口（共 32 个窗口），依次（m/z 400-425、m/z 425-450、……、m/z 1175-1200）将窗口内所有的离子选择、碎裂，并检测该窗口内离子产生的所有碎片，一次循环获得 32 张二级谱图，并不断循环往复地进行采集（图 3）。

图 3. DIA 采集原理

Orbitrap 所具有的超高分辨率（_ 140,000）、超快扫描速度（32–64 ms）、超高灵敏度（amol 级），使 DIA 相比目前其他类似技术，如 SWATH 等，能够为用户带来更出色的性能体验。此外，Orbitrap 灵活多样的采集方式，还能为用户带来更灵活的方法设置：(1)根据样本的复杂程度使用更窄的选择窗口（如 20 m/z ）或不对称窗口（在出峰密集的范围使用更窄的选择窗口），实现更好的选择性；(2) 根据肽段的信号强度调整离子注入时间及分辨率，达到更高的灵敏度；(3) 针对大规模样本使用更快的扫描速度和更短的梯度，进一步提高分析效率；(4) 加入一级全扫描，采集碎片的同时获得母离子信息，实现更准确的定性定量。

2. msxDIA

Orbitrap 超高分辨质谱除了为用户带来超高分辨率、超快扫描速度和超高灵敏度的分析性能外，先进的设计理念使其具有其他任何质谱都无法实现的功能——多重累积技术（Multiplexing, msx）。将多重累积技术与 DIA 相结合，形成独一无二的 msxDIA，进一步缩小 DIA 的选择窗口，提高 DIA 的选择性。

msxDIA 随机将 5 个 4 m/z 窗口（或 2 个 10 m/z 窗口）依次选择、碎片、并累积在一起，最后同时注入 Orbitrap 进行扫描，获得5 个 4 m/z 窗口（或 2 个 10 m/z 窗口）中全部碎片信息的谱图，再随机选择另外 5 个 4 m/z 窗口（或 2 个10 m/z 窗口）分析并依次进行下去，直至覆盖整个全扫描范围。msxDIA 总步长为 20 m/z ，不影响扫描速度，而这 20 m/z 由 5 段（或 2 段）独立的窗口组成，客观上使选择窗口缩小到仅 4 m/z （或 10 m/z 窗口）。图 4 以 2 x 10 m/z 模式为例，展示了 msxDIA 的原理。

图 4. msxDIA 采集原理（2 x 10 m/z 模式）

msxDIA 采集得到的数据再利用 Skyline 软件去多重累积（de-multiplexing），即可将每个碎片及响应强度归属到特定窗口，实现与 Shotgun、SRM/MRM 相当的选择性，最大程度地减少共流出肽段和杂质的干扰（图 5）。msxDIA 是 Orbitrap 独一无二的全新扫描技术，其成果最先由 Skyline 的开发者、华盛顿大学 MacCoss 教授团队提出，并发表在《Nature Method》杂志上（Nat. Methods, 2013, 10(8): 744-746）。