数据非依赖采集DIA 解决方案（四）
Skyline 软件
Skyline 软件是华盛顿大学 MacCoss 教授实验室开发的目标蛋白质组学分析软件（https://skyline.gs.washington.edu），是 DIA/SWATH 数据处理的权威工具，由于功能全面、性能强大而受到普遍认可，是目前使用最广泛的 DIA/SWATH 解析软件。通过与Thermo Fisher Scientific 的紧密合作，MacCoss 教授实验室有针对性地优化了 Skyline 对 Orbitrap 数据的处理，一步实现从原始数据到最终结果的完整 DIA 解析流程，使 Orbitrap DIA 如虎添翼。
以 Proteome Discoverer 软件（或 MaxQuant、Mascot 等）搜库鉴定结果为谱图库，导入 Skyline 软件；设置肽段、离子对挑选规则；将符合条件的肽段及子离子从谱图中挑选出来，生成 Target List；导入 DIA/msxDIA 数据，根据 Target List 提取离子对色谱峰，进行子离子匹配和峰面积计算，实现对肽段的同时定性和定量（图 13）。若样品中加入标准肽段，则可利用标准肽段进行保留时间校正。
图 13. Skyline 处理 DIA 数据完整流程
图 14. 使用 mProphet 进行统计学分析并卡值过滤
定性
使用 Skyline 内嵌的 mProphet 卡值工具对谱图匹配结果进行统计学分析，综合考虑 dotp 分数、信号响应、保留时间、质量偏差等因素计算 q 值，过滤结果，获得高度可信的肽段定性结果（q < 0.01）（图 14）。
定量
经定性卡值（q < 0.01）后，最终获得所有可靠离子对的色谱峰面积和 CV 值，将结果以 Excel 表格式导出，使用 CV < 20% 的离子对峰面积进行定量分析，完成 DIA 分析工作（图 15）。
图 15. 获得离子对峰面积、CV 值，计算定量结果
七、应用实例
该应用实例为采用 DIA 方法完成的大规模蛋白质组学及磷酸化蛋白质组学定量实验。在 120 分钟的有效梯度内，以 q < 0.01 和CV < 20% 为过滤条件，在 200 ng Hela 全细胞裂解液中同时定量 3597 个高可信度蛋白质（21710 肽段）；并在同样的实验条件下，同时定量了 11341 条高可信度的大鼠磷酸化肽段。实验证实，无论是常规的定量蛋白质组学实验还是翻译后修饰定量研究，DIA 方法都具有无可比拟的定量性能。
八、文献资料
