数据非依赖采集DIA 解决方案（二）
二、特点与优势
数据非依赖采集（DIA）：
• 采集所有离子及碎片谱图，不丢失任何信息，重现性好；
• 数据易于追溯，即使目前的水平无法发现某些蛋白/ 化合物，未来可以回溯；
• 无需优化方法，对于易降解样品可以即刻采集，获得数据后再深入挖掘；
• 基于碎片离子（即母子离子对）定量，选择性好，与 SRM/MRM 相当；
• 循环时间固定，扫描点数均匀，定量准确度高；
• 通量无上限，同时监测所有目标蛋白/ 化合物；
• 相同肽段不同翻译后修饰位点的定量区分与辨别。
基于 Orbitrap 的数据非依赖采集（DIA）：
• 通常 35,000–60,000 分辨率采集，对复杂样品定性定量准确度高；
◆ Q-TOF DIA* 采集分辨率为 20,000 左右
• 质量轴长期稳定地保持在 1 ppm，无需内标校正或频繁外标校正，数据更放心、通量更高；
◆ Q-TOF DIA* 采集需内标校正或频繁外标校正
• Amol（10-18 mol）级的超高灵敏度，谱图质量高；
◆ Q-TOF DIA* 采集灵敏度低
• 12–20 Hz 的超快扫描速度，同时保持 amol 级的超高灵敏度；
◆ Q-TOF DIA* 采集提高扫描速度则丢失灵敏度
• 动态范围及线性范围达 5 个数量级以上；
◆ Q-TOF DIA* 采集动态范围在 3~4 个数量级
• 独一无二的多重累积 msxDIA，进一步提高选择性；
◆ Q-TOF DIA* 无此功能
• 灵活多样的扫描功能，实现 pSMART、WiSIM 等诸多独特 DIA 模式。
◆ Q-TOF DIA* 扫描模式单一
*: 此处 DIA 指 Ruedi Aebersold 发展的“Sequential Window Acquisition Trough High-resolution”技术（Mol. Cell. Proteomics, 2012, 11(6): O111.016717）
三、工作流程
Thermo Fisher Scientific 建立的专门针对基于 Orbitrap 的数据非依赖采集（DIA）解决方案，工作流程（图 6）统一、方法成熟、简单易用，适用于任何复杂生物学样本和临床样本的高通量蛋白质组学定量分析。
基于 Orbitrap 的 DIA 解决方案分为三步：首先，样本前处理与经典的 Shotgun 流程完全一致，样本经蛋白提取、酶解、除盐，再根据需要经过特定的分离富集、纯化后，即可直接进样分析，或加入混合标肽后再进样分析（保留时间校正）；然后，无需事先了解样本信息，直接使用统一的 DIA 模板，即可快速、高通量地进行 Orbitrap 质谱采集，获得高质量 DIA 数据；最后，DIA 数据使用权威 Skyline 软件与谱图库匹配打分，获得可信的鉴定结果，并自动挑选响应最高、选择性最好的若干子离子，进行离子对色谱峰提取，即可获得准确的定量信息。
图 6. 基于 Orbitrap 的数据非依赖采集（DIA）解决方案
四、Q Exactive 系列 Orbitrap 质谱仪
静电场轨道阱 Orbitrap 超高分辨质量分析器
基于傅里叶变换原理的静电场轨道阱 Orbitrap 是 30 年来唯一基于全新理论的质量分析器，集超高分辨率、超高质量精度、超高灵敏度等卓越性能于一体，还具有质量轴极其稳定、操作维护简单、使用成本低廉等优势。从 2005 年第一台商品化的 Orbitrap 质谱上市以来，极大地推动了以蛋白质组学为代表的高水平科学研究的发展，迅速成为蛋白质组学研究的唯一金标准。据统计，近年来，使用 Orbitrap 在 Nature、Science、Cell 等高水平期刊上发表论文的数量，是使用所有其他高分辨质谱发表论文数量总和的三倍，成为前沿科学研究的利器（图 7）。
图 7. Orbitrap 结构图及发表高水平论文趋势比较
图 8. 定量分析的利器——Q Exactive 系列超高分辨 Orbitrap 质谱仪
五、方法设置与数据采集
1. DIA
Q Exactive 的 DIA 方法编辑简单、易上手，流程一目了然，无需任何 DIA 分析经验。仅三步，即可完成全部方法设置（图 9）：(1)在模板中将 DIA 模块拖入方法流程（若加入一级扫描，则在 DIA 模块前拖入 Full Mass 模块）；(2) 根据需要修改 DIA 模块中的分辨率（通常设 35000）和窗口宽度（若实际窗口步长为 25 m/z ，则设 26 m/z ，多 1 m/z 为窗口之间 Overlap）；(3) Inclusion List中生成每个窗口的中间值（m/z ）作为 target。三步完成后保存方法，即刻开始样品数据采集。
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