PCR-ELISA实验
实验概要
本实验介绍了PCR-ELISA的操作流程。PCR-ELISA是用免疫学方法检测PCR产物，这比常规用电泳方法及Southern blot要简便、省时，可同时处理大量标本，便于自动化。
实验原理
PCR-ELISA的原理是在做PCR扩增时应用生物素(biotin)标记的引物，这样PCR的产物就可结合到亲和素(avidin)包被的塑料板上，再用地高辛标记的探针与PCR产物杂交，然后就可以用抗地高辛的酶联反应检测。
实验步骤
1. PCR扩增
按基本PCR技术做DNA扩增，只是所用的引物至少有一个是5′端用生物素标记的。通常可在DNA合成仪上直接合成5′端带生物素标记的引物。
2. 地高辛标记的探针杂交
将地高辛标记的DNA探针0.1μg稀释于90μl 50mmol/L TrisHCl，pH8.3,80mmol/L KCl中。取10μl PCR产物加到管中，加热至90℃，缓慢冷却至67℃。离心1s，置52℃水浴保温1h。
3. 将杂交产物固定到塑料板上
1) 可用商品供应的亲和素包被的酶标板，亦可用普通酶标板按常规方法将亲和素包被上；
2) 每孔加100μl封闭液(含10mg/ml BSA，1mg/ml鱼精DNA的PBS)，室温1h；
3) PBST洗3次；
4) 将地高辛探针杂交的PCR产物直接加到酶标板上，室温孵育1h；
5) PBST洗3次。
4. ELISA检测
1) 将抗地高辛抗体稀释于PBS中，每孔加100μl，室温孵育1h；
2) PBST洗3次；
3) 将酶标的第二抗体稀释于PBS中，每孔加100μl，室温孵育1h；
4) PBST洗3次；
5) 每孔加100μl酶底物，在颜色适合后终止反应；
6) 在酶标仪上读结果。
注意事项
本法的敏感性可与放射性同位素标记相比，但又避免了同位素的危险。做大量样品时，应统一配制反应液，再小心地分装到各反应管中，以免污染，并使各管条件一致。非特异性反应常由于地高辛标记的DNA探针与酶标板直接结合所致，因此在封闭液中一定要包括足量的鱼精DNA。
