Celigo技术在基因治疗和病毒研究中的应用（三）
Disucssion
这里所介绍的使用荧光检测的自动蚀斑计数方法有助于加快蚀斑检测的速度。但是，有几种类型的感染性病毒滴度实验不会形成蚀斑。半数组织培养感染剂量（TCID50）就是另一种常用的病毒滴定方法。TCID50是终点稀释测定法，用于确定感染50％接种细胞所需的病毒样品稀释度。由于蚀斑和TCID50分析都是要历时多天且通量较低，因此急需其他更快的方法。带有GFP标签的腺病毒载体，可以通过流式细胞术检测被感染的细胞，该方法通常需要大约一天的时间，样品用流式方法和蚀斑实验检测具有相近的病毒滴度结果，这也使其成为蚀斑实验颇具吸引力的替代方法。
已有报道称使用阴离子交换柱的高效液相色谱（HPLC）方法可以定量杆状病毒中的病毒颗粒。用SYBR绿色荧光染料标记病毒的DNA后，可在25分钟内从阴离子交换柱上洗脱到病毒粒子。尽管该方法可以定量一个样品中存在的病毒颗粒数量，但不一定检测的是感染性病毒的数量。
此外，微滴式数字PCR（ddPCR）技术还可以量化反应中目标DNA的绝对数量。
此处描述的自动蚀斑计数方法是传统蚀斑实验的一大进步，对于不形成蚀斑感染的类“蚀斑”形成实验也有所帮助。
例如，有种方法是用来确定腺病毒5（Ad5，一种辅助病毒）的感染性的，叫做灶斑形成实验（focus formation assay）。
与蚀斑测定相似，用连续稀释后的病毒样品感染细胞，然后将细胞固定，与抗病毒的HRP偶联抗体一起孵育，并用DAB底物显色。用Ad5感染的细胞形成可计数的灶斑（Foci），结果以每毫升感染单元（ifu/mL）的形式表示。通过参数优化，Celigo可用于识别和计数单个灶斑，从而有助于提高灶斑的读检速度。
已有研究报道，一个类似的的荧光灶形成实验（fluorescent focus formation
assay）可取代鼠诺如病毒（MNV）的蚀斑实验。在该实验中，MNV抗原带有荧光标签，由于病毒抗原的表达早于蚀斑的形成，因此该方法可以比蚀斑实验更快速地定量感染滴度。Celigo在该实验中可用于自动计数灶斑形成单元（focus-forming
units，FFU）。
最近也有不少研究，将将近红外荧光与LI-COR Biosciences的胞内Western blot系统相结合，也证明了相对于传统蚀斑实验，在检测灵敏度和速度方面也有一定程度的提高。不过，与LI-COR系统不同的是，我们采用的Celigo成像分析仪除了荧光检测外，还可以用于非荧光斑块的成像识别。
电阻抗技术也曾被用来评估细胞的病毒感染。研究表明，阻抗技术可用于实时监测病毒与细胞间的相互作用，并检测某些抗病毒药物的瞬时效用。但是，此技术的工作流程无法计算传统蚀斑实验中蚀斑形成单位（plaque-forming unit，PFU）的数值。
尽管有很多新方法用于感染性病毒滴度的定量测定，但蚀斑实验和TCID50检测仍是病毒滴定的金标准。这里描述的自动蚀斑计数方法是对传统方法的完善和改进。通过利用自动计数和计算机算法来计数蚀斑，消除了分析者的主观因素。使用Celigo成像分析仪还可以大大减少蚀斑计数的时间并提高数据一致性。当该技术应用于48孔或96孔板时，还可以显著地提高样品通量，从而助益于工艺优化环节中的大量样品的分析。此外，通过整合蚀斑的荧光检测，检测时长可以减少40％，同时保持与传统蚀斑实验相同的计数性能。
使用基于计算机的成像系统的另一个优点是提高了数据的获取、结果记录以及可追溯性。同时，存储和回顾图像的功能使得设置实验验收标准更加清晰，并在培训新的分析人员时提供指导和示范。在质量控制或良好生产规范（GMP）环境中，每项实验运行的过程都同时需要分析和审核人员。通过应用具有自动蚀斑计数的板式成像分析仪，每一次分析结果和数据回顾的过程都能够被完整地记录，并且保存的原始细胞图像以供监管机构进行备案或审计。
我们的目的是评估可以轻松应用到当前蚀斑实验工作流程中的新技术，自动生成PFU值，并提高实验的可靠性，灵敏度和速度。这项研究强调了通过自动成像技术等简单的解决方案对经典检测方法的改进。
