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分子克隆-蛋白表达实验指南（十四）

2020.7.27

RbCl制备感受态细胞
需准备的灭菌器具和培养液：
SOB，Buffer 1，Buffer 2，3×200ml广口瓶，1.5ml
EP管，1×500ml离心瓶（按200ml摇菌量计算），2×50ml离心管，2×移液管（用于加Buffer 1），液氮，冰
离心管，EP管，移液管使用前均需要放在4C预冷。离心机使用前也应预冷
1．将DH5α(上批做好的感受态菌或保种的DH5a)划在LB平板上，370C培养10-12小时
2．挑单克隆于4ml SOB培养液（SOB培养液中的MgCl2 和MgSO4必须摇菌之前加，细菌活化也可以用LB培养液），370C培养过夜
3．取2ml过夜菌到200ml SOB培养液（1000ml三角椎瓶），370C培养至OD600＝0.35（约1.5小时，OD最好不能超过0.4
4．将菌迅速置于盐冰浴上15分钟（盐使冰浴更冷，也可以不用盐冰浴），同时预冷500ml离心瓶和离心机
5．将菌分装于500ml离心瓶中，5000rpm，40C离心5分钟，弃上清
6．加入64ml Buffer1，小心的吹打细菌使之混匀（最好从瓶壁上离菌落3－4cm处吹下buffer
1，不要直接吹打菌落，冰上操作。加buffer1时先预加30ml，当菌落吹打均匀后再补加34ml
buffer），冰上15min。4800rpm，40C离心5分钟，弃上清
7．将菌平均分装于两个50ml离心管中，分别加入8ml
Buffer2，悬浮细胞，悬浮方法同step6，置冰上。立即分装为100ul/每管（1.5ml离心管需预冷，无菌操作）
8．分装好的感受态菌立即放入液氮中，-700C保存
     SOB                      200ml
        Tryptone                       4g
        Yeast extract                    1g
        NaCl                          0.12g
        KCl                           0.1g
        Autoclave
        用前加入 1M MgCl2 到 10mM
                 1M MgSO4到 10mM (MgCl2，MgSO4混合液过滤除菌)

     Buffer1               64ml
        RbCl                 0.768g
        MnCl2*4H2O           0.636g
        CaCl2*2H2O           0.096g
        Glycerol               9.6g
        KAC                 1.92ml of 1M stock PH7.5
        0.2M Hac 调PH至5.8
        0.22um过滤器灭菌,40C保存

Buffer 2              20ml
        MOPS              0.4ml of 0.5M stock PH6.8 MOPS不能高压灭菌
        RbCl               0.024g
        CaCl2*2H2O          0.22g
        Glycerol             3g
        0.22um过滤器灭菌,40C保存