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分子克隆-蛋白表达实验指南（十九）

2020.7.27

Desired pH Volume of 1M K2HPO4 (mL)Volume of 1M KH2PO4 (mL)
              5.8 8.591.5
              6.0 13.286.8
              6.2 19.280.8
              6.4 27.872.2
              6.6 38.161.9
              6.8 49.750.3
              7.0 61.538.5
              7.2 71.728.3
              7.4 80.219.8
              7.6 86.613.4
              7.8 90.89.2
              8.0 94.0 6.0

Dilute the combined 1M stock solution to 1 litre with distilled H2O

在大肠杆菌中，当外源蛋白高水平表达的时候，极易形成包涵体，为蛋白纯化等下游工作带来很大的麻烦。下面是一些可以参考的有助于提高目的蛋白可溶性表达的实验方案：

1.降低蛋白合成的速度。可以通过以下方法实现：
    a.降低培养温度
    b.使用弱启动子
    c.使用低拷贝数的质粒表达载体
    d.降低诱导物的浓度
2.改变培养基。
    a.培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子
    b.加入缓冲液保持pH稳定
    c.加入1%的葡萄糖，抑制lac启动子
    d.加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因子
    e.加入乙醇， thiols and disulfides等？
3.与分子伴侣或折叠酶共表达。
     常用的分子伴侣有：
     GroES-GroEL
     DnaK-DnaJ-GrpE
     ClpB
    常用的折叠酶有：
    peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPI's)
    disulfide oxidoreductase (DsbA) and disulfide isomerase (DsbC)
    protein disulfide isomerase (PDI)

4.分泌表达。使目的蛋白分泌到周质空间。
     周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成，而胞内则是还原性的。
     周质空间有折叠酶DsbA和DsbC的存在，帮助蛋白正确折叠。
     周质空间很少有蛋白酶存在，不会被水解。
     可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。

5.使用特定的菌株。

      AD494, which has a mutation in thioredoxin reductase (trxB).
      Origami，a double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and glutathione
reductase (gor).

6.与可溶性partner融合表达。

7.表达目的蛋白的一个片段。> 70 kDa的蛋白在大肠杆菌中是很难表达的。

8.体外去折叠，重新折叠。