分子生物学常用实验技术（十三）
2. 从RNA 合成单链cDNA 探针cDNA 单链探针主要用来分离cDNA 文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA
探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT 为引物合成cDNA
探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列。(2)
可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA 中通常含有多种不同的RNA
分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA 为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA 中的目的序列。反转录得到的产物RNA/DNA
杂交双链经碱变性后,RNA 单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50 柱层析即可得到单链探针。
材料：已提纯的RNA 或mRNA
设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
试剂：
(1)合适的引物：随机引物或oligo(dT)15-18。
(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。
(3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。
(4)反转录酶(200000 单位/ml)。
(5)100mmol/L DTT。
250mmol/L MgCl2。
(7)1mol/L KCl。
0.5mol/L EDTA (pH8.0)。
(9)10% SDS。
(10)RNasin(40 单位/ml)。
操作步骤:
(1)在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂：
RNA 或mRNA 10.0ml
合适的产物(1mg/ml) 10.0ml
1mol/L Tris?Cl(pH7.6) 2.5ml
1mol/L KCl 3.5ml
250mmol/L MgCl2 2.0ml
5mmol/L dNTP 10.0ml
[a-32P]dCTP 10.0ml
0.1mol/L DTT 2.0ml
Rnasin 20U
加水至48ml
反转录酶(200000 单位/ml) 2ml
混匀后,稍稍离心，37℃保温2 小时。
(2) 反应完毕后加入下列试剂： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml
(3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68℃保温30 分钟以水解RNA。
(4) 冷却至室温后, 加入10ml 1mol/L Tris?Cl (pH7.4)。混匀。然后加入3ml 2mol/L HCl。
(5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50 柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。[注意] RNA 极易降解，因而实验中的所有试剂和器皿均应在DEPC 处理后，灭菌备用。
三、末端标记DNA 探针
现以Klenow 片段标记3'末端为例说明末端标记的方法。
1、材料：待标记的双链含凹缺3'末端的DNA。
2、设备：高速台式离心机，水浴锅等。
3、试剂：
(1)3 种不含标记的dNTP 各为200mmol/L。
(2)合适的限制酶。
(3)[α-32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。
(4)Klenow 片段(5U/ml)。
(5)10×末端标记缓冲液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/mlBSA。
4、操作步骤：
(1)25μl 反应体系中用合适的限制酶酶切1μg 的DNA。
(2)按下列成分加入试剂并混匀： 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端标记缓冲液5ml 2mmol/L3 种dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 适量加水至50ml
(3)加入1 单位的Klenow 片段,室温下反应30 分钟。
(4)加入1ml 2mmol/L 第四种核苷酸溶液, 室温保温15 分钟。
(5)70℃加热5 分钟,终止反应。
用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用Sephdadex G-50 柱层析分离标记的DNA。
[注意]
1、利用本方法可对DNA 分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA 片段。
2、对DNA 的纯度不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。
3、末端标记还有其他的一些方法，如利用T4 多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的DNA 和平末端凹缺DNA 分子，也可利用该酶进行交换反应标记5'末端。
四、寡核苷酸探针
利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对,可以准确地设计杂交条件,以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交,对于一些未知序列的目的片段则无效。
1、材料：待标记的寡核苷酸(10pmol/μl)。
2、设备：高速离式离心机，恒温水浴锅等。
3、试剂：
(1)10×T4 多核苷酸激酶缓冲液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.6), 0.1mol/L MgCl2 , 50mmol/L DTT,
1mmol/L Spermidine?HCl, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(2)[γ-32 P] ATP(比活性7000Ci/mmol; 10mCi/ml)。
(3)T4 多核苷酸激酶（10 单位/ml）。
4、操作步骤：
(1)100ng 寡核苷酸溶于30ml 水中。置65℃变性5 分钟，迅速置冰溶中。
(2)立即加入下列试剂：
10×激酶缓冲液5ml
[g-32P]ATP(比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10ml
T4 多核苷酸激酶2ml
加水至50ml
混匀后置37℃水浴20 分钟。
(3)再加入20 单位T4 多核苷酸激酶，置37℃水浴20 分钟后立即置冰浴中。
(4)Sephadex G-50 柱层析。
此方法是在每个探针的5'末端多加了一个磷酸，理论上，这会影响其与DNA
的杂交。因此，建议使用Klenow DNA
聚合酶的链延伸法获得高放射性的寡核苷酸探针。除了常见的同位素标记探针外，还有利用非同位素标记探针和杂交的方法，许多公司都有不同的非同位素标记探针的杂交系统出售，可根据这些公司所提供的操作步骤进行探针的标记和杂交。
五、RNA 探针
许多载体如pBluescript,
pGEM 等均带有来自噬菌体SP6 或E.coli 噬菌体T7 或T3 的启动子,它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA 的RNA
聚合酶所识别,合成特异性的RNA。在反应体系中若加入经标记的NTP，则可合成RNA 探针。RNA 探针一般都是单链,它具有单链DNA
探针的优点,又具有许多DNA 单链探针所没有的优点，主要是： RNA NA 杂交体比DNA NA 杂交体有更高的稳定性,所以在杂交应中RNA
探针比相同比活性的DNA 探针所产生信号要强。RNA:RNA 杂交体用RNA 酶A 酶切比S1 酶切DNA:RNA 杂交体容易控制,所以用RNA
探针进行RNA 结构分析比用DNA 探针效果好。噬菌体依赖DNA 的RNA 聚合酶所需的rNTP 浓度比Klenow 片段所需的dNTP
浓度低,因而能在
较低浓度放射性底物的存在下,合成高比活性的全长探针。用来合成RNA 的模板能转录许多次,所以RNA 的产量比单链DNA 高。并且用来合成RNA 的模板能转录多次，可获得比单链DNA 更高产量的RNA。
反应完毕后，用无RNA
酶的DNA 酶Ⅰ处理,即可除去模板DNA,而单链DNA 探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA 分离。另外噬菌体依赖于DNA 的RNA
聚合酶不识别克隆DNA 序列中的细菌、质粒或真核生物的启动子，对模板的要求也不高,故在异常位点起始RNA
合成的比率很低。因此,当将线性质粒和相应的依赖DNA 的RNA 聚合酶及四种rNTP 一起保温时,所有RNA
的合成,都由这些噬菌体启动子起始。而在单链DNA 探针合成中,若模板中混杂其他DNA
片段,则会产生干扰。但它也存在着不可避免的缺点，因为合成的探针是RNA，它对RNase
特别敏感，应而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase；另外如果载体没有很好地酶切则等量的超螺旋DNA
会合成极长的RNA，它有可能带上质粒的序列而降低特异性。
第二节几种常见的杂交
分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA 或RNA 分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：
(1) Southern 杂交NA 片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA 或RNA。
(2)
Northern 杂交:RNA 片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA
或RNA。根据杂交所用的方法,另外还有斑点(dot)杂交、狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交等。有3
种固相支持体可用于杂交:硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541 滤纸。不同商标的尼龙膜需要进行不同的处理，在DNA
固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。Whatman 541
滤纸有很高的湿强度,最早用于筛选细菌菌落。该滤纸主要用于筛选一些基因文库。固定化DNA
的杂交条件基本与使用硝酸纤维素滤膜时所建立的条件相同。Whatman 541
滤纸与硝酸纤维素滤膜相比有一些优点:它更便宜,杂交中更耐用,干燥过程中不易变形和碎裂等。然而若变性过程不小心,杂交信号的强度会明显弱于用硝酸纤维素滤膜时所得到的信号强度。因此,常规的细菌筛选和各种杂交时仍选用硝酸纤维素滤膜作为固相支持体。
一、Southern 杂交
Southern 杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:
(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA 原位变性。
(2) 将DNA 片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。
(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。
(4) 让探针与同源DNA 片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。
(5) 通过显影检查目的DNA 所在的位置。
Southern 杂交能否检出杂交信号取决于很多因素,包括目的DNA 在总DNA 中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA
量以及探针与目的DNA 间的配对情况等。在最佳条件下,放射自显影曝光数天后, Southern 杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg 与32 P
标记的高比活性探针的(>109cpm/μg)互补DNA。如果将10μg 基因组DNA
转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb 大小的单拷贝序列。将DNA
从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3 种1)毛细管转移。本方法由Southern 发明,故又称为Southern
转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。(2)电泳转移。将DNA
变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA
片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。(3)
真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速,在30
分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern 转移强2-3
倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。
1、材料： 待检测的DNA，已标记好的探针。
2、设备： 电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，滤纸。
3、试剂：
(1)10mg/ml 溴化乙锭（EB）。
(2)50×Denhardt's 溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA 加水至500ml,过滤除菌后于-20℃储存。
(3)1×BLOTTO:5g 脱脂奶粉，0.02%叠氮钠，储于4℃。
(4)预杂交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml 鲑鱼精子DNA, 50%甲酰胺。
(5)杂交溶液:预杂交溶液中加入变性探针即为杂交溶液。
0.2mol/L HCl。
(7)0.1% SDS。
0.4mol/L NaOH。
(9)变性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH 加水至1000ml。
(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris?Cl, 加水至1000ml。
(11)硝酸纤维素滤膜。
(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸钠,用1mol/L HCl 调节pH 至7.0;
(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC 稀释。
4、操作步骤：
(1) 约50μl 体积中酶切10pg-10μg 的DNA, 然后在琼脂糖凝胶中电泳12-24 小时(包括DNA分子量标准物)。
(2) 500ml 水中加入25μl 10mg/ml 溴化乙锭,将凝胶放置其中染色30 分钟, 然后照相。
(3)
依次用下列溶液处理凝胶,并轻微摇动: 500ml 0.2mol/L HCl 10 分钟, 倾去溶液(如果限制性片段>10kb,
酸处理时间为20 分钟)，用水清洗数次,倾去溶液; 500ml 变性溶液两次,每次15 分钟,倾去溶液; 500ml 中和溶液30
分钟。如果使用尼龙膜杂交，本步可以省略。
(4) 戴上手套,在盘中加20×SSC 液,将硝酸纤维素滤膜先用无菌水完全湿透,再用20×SSC
浸泡。将硝酸纤维素滤膜一次准确地盖在凝胶上,去除气泡。用浸过20×SSC 液的3 滤纸盖住滤膜,然后加上干的3 滤纸和干纸巾,根据DNA
复杂程度转移2-12 小时。当使用尼龙膜杂交时，该膜用水浸润一次即可，转移时用0.4mol/L NaOH 代替20×SSC。简单的印迹转移2-3
小时,对于基因组印迹,一般需要较长时间的转移。
(5)
去除纸巾等,用蓝色圆珠笔在滤膜右上角记下转移日期,做好记号,取出滤膜,在2×SSC 中洗5分钟,凉干后在80℃中烘烤2
小时。注意在使用尼龙膜杂交时，只能空气干燥，不得烘烤。将滤膜放入含6-10ml
预杂交液的密封小塑料袋中,将预杂交液加在袋的底部,前后挤压小袋,使滤膜湿透。在一定温度下(一般为37-42℃)预杂交3-12
小时，弃去预杂交液。
(7) 制备同位素标记探针（参见第一节），探针煮沸变性5 分钟。在杂交液中加入探针,混匀。如步骤（6）将混合液注入密封塑料袋中,在与预杂交相同温度下杂交6-12 小时。
(9) 取出滤膜,依次用下列溶液处理,并轻轻摇动: 在室温下, 1×SSC/0.1% SDS, 15 分钟, 两次。在杂交温度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15 分钟, 两次。
(10) 空气干燥硝酸纤维素滤膜,然后在X 光片上曝光。通常曝光1-2 天后可见DNA 谱带。对于≥108 cpm/μg 从缺口平移所得探针,可很容易地从10μg 哺乳DNA 中检测到10pg 的单拷贝基因。
二、Northern 杂交
Northern
杂交与Southern 杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去除RNA 中的二级结构,保证RNA
完全按分子大小分离。变性电泳主要有3 种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern
转移相同的方法将RNA 转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。
1、材料：待检测的RNA 及制备好的探针。
2、设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，X-光片，杂交袋，硝酸纤维素膜或尼龙膜。
3、试剂：
(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g 柠檬酸钠，溶于800ml 水中，用10mol/LNaOH 调pH 至7.4，定溶到1L。
(2)其他试剂：与Southern 杂交试剂类似，只是所有的试剂均应用DEPC 处理。
4、操作步骤：
(1)RNA 经变性电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA 转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法与转移DNA的方法相似。
(2)转移完毕后,以6×SSC 溶液于室温浸泡此膜5 分钟,以除去琼脂糖碎片。
(3)将该杂交膜夹于两张滤纸中间,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2 小时。
(4)
用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为1-2 小时。若于42℃进行,应采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's
试剂，0.1% SDS；若于68℃进行,应采用:6×SSC，2×Denhardt's 试剂，0.1%SDS，（注意：BLOTTO
不能用于Northern 杂交）。
(5)
在预杂交液中加入变性的放射性标记探针,如欲检测低丰度mRNA,所用探针的量至少为0.1μg,其放射性比活度应大于2×108
cpm/分?μg,放在适宜的温度条件下杂交16-24 小时。用1×SSC、0.1% SDS 于室温洗膜20 分钟,随后用0.2×SSC、0.1%
SDS 于68℃洗膜3 次,每次20 分钟。
(7) 用X 光片(Kodak XAR-2 或与之相当的产品)进行放射自显影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小时。
[注意]
(1)如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的RNA
大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH 浸泡凝胶20 分钟,部分水解RNA 并提高转移效率。浸泡后用经DEPC
处理的水淋洗凝胶,并用20×SSC 浸泡凝胶45 分钟。然后再转移到滤膜上。
(2)在步骤(3)的操作中，如果滤膜上含有乙醛酰RNA,杂交前需用20mmol/L Tris?Cl (pH8.0)于65℃洗膜,以除去RNA 上的乙二醛分子。
(3)RNA 自凝胶转移至尼龙膜所用方法，与RNA 转移至硝酸纤维素滤膜所用方法类似。
(4)含甲醛的凝胶在RNA
转移前需用经DEPC
处理的水淋洗数次,以除去甲醛。当使用尼龙膜杂交时注意，有些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固着核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH
溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰RNA，同时可部分水解RNA，并提高较长RNA 分子(>2.3kb)转移的速度和效率。
此外，碱可以除去mRNA 分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脱的步骤。乙醛酰RNA 在碱性条件下转移至带正电荷尼龙膜的操作也按DNA
转移的方法进行，但转移缓冲液为7.5mmol/LNaOH，转移结束后(4.5-6.0 小时)，尼龙膜需用2×SSC、0.1%SDS
淋洗片刻、于室温晾干。
(5)尼龙膜的不足之处是背景较高,用RNA
探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中,会导致杂交背景明显升高,可通过提高预杂交和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。如用中性缓冲液进行RNA
转移,转移结束后,将晾干的尼龙膜夹在两张滤纸中间,80℃干烤0.5-2 小时,或者254nm 波长的紫外线照射尼龙膜带RNA
的一面。后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进RNA
上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,而过度照射却使RNA 上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。
