分子生物学常用实验技术（十五）
第十章测序技术
在分子生物学研究中，DNA
的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger 等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam
和Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G
四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE 胶上电泳进行检测，从而获得DNA 序列。目前Sanger
测序法得到了广泛的应用。Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA
聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP
缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T 或C 处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs
和ddNTPs
的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
第一节非同位素银染测序系统操作技术
一、概述：
Promega
公司的SILVER SEQUENCETM DNA
测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90
分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。此外, SILVER SEQUENCETM 系统用未修饰的5'OH 寡聚核苷酸作为引物，
减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。Taq
DNA 聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA 聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰品，对于双链DNA
模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。SILVER SEQUENCETM
系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP 可清除由GC
丰富区域所引起的条带压缩现象。退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR
产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC
含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer 的GC 含量约为50%的引物可得到最佳结果。由于本系统采用热循环装置,
与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA
产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03--2pmol 模板DNA, 随模板种类而定。(2).
在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA 模板(如PCR
反应产物)快速重退火所引起的问题。(3).高温聚合酶反应减弱了DNA 模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。
二、材料待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。
三、设备高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR 仪。
四、试剂
（1）SILVER SEQUENCETM DNA 测序试剂盒。
（2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺W/V，2%甲叉双丙烯酰胺W/V)：95g丙烯酰胺，5g 甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm 过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2 周。
（3）10%过硫酸铵，0.5g 过硫酸铵溶于4ml 水中，定容至5ml，应新配新用。
（4）10×TBE
缓冲液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g
Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ?2H2O，溶于双蒸水中定容至1 升，置于4℃下可贮存2 周，其pH 约为8.3。
（5）TBE 电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE 备用。
（6）TEMED
（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2 升备用。
（8）染色溶液：硝酸银2 克，甲醛3ml，溶于2 升超纯水中备用。
（9）显影溶液：60 克碳酸钠（Na2CO3)溶于2 升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。
（10）95%乙醇。
（11）0.5%冰乙酸。
（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
五、操作步骤：
成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA
模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点：
（1） DNA 的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA 一起电泳。
（2） 分光光度法对于很多DNA 提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA 浓度估计，混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm 光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA 浓度。
（3） DNA 制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA 样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm 光吸收。
（一）测序反应：
1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf 管(G、A、T、C)。每管加入2ml 适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1 滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。
2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf 管中混合以下试剂：
（1） 样品反应：
质粒模板DNA 2.1pmol
5×测序缓冲液5ml
引物4.5pmol
无菌ddH2O 至终体积16ml
（2）对照反应
pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg) 4.0ml
5×测序缓冲液5ml
pUC/M13 正向引物(4.5pmol) 3.6ml
无菌ddH2 O 至终体积16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2 步)中加入1.0ml 测序级Taq DNA 聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。
4. 从第3 步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml 加入每一个d/ddNTP 混合物的管内。
5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf 管底部。
6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350 碱基的长度。
7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA 测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。
[注意] 1、测序所用模板DNA 的量一般按下面要求加入：模板种类/长度模板量
200bp (PCR 产物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp（超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)
由于超螺旋质粒产生的信号比松驰的线性双链DNA 弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。
2、计算与4.5pmol 相当的引物纳克数可用以下一般公式：
4.5pmol=1.5ng×n,其中n 为引物碱基数
计算与1pmol 相当的引物微克数可用以下一般公式：
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n 为模板碱基对数
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n 为模板碱基数
3、为阻止Taq DNA 聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1 开始。
模式1：适用于引物<24 碱基或GC 含量<50%
95℃ 2 分钟。然后： 95℃ 30 秒(变性), 42℃ 30 秒(退火), 70℃ 1 分钟(延伸)。
模式2:适用于≥24 碱基或略短的GC 含量≥50%的引物。
95℃ 2 分钟, 然后: 95℃ 30 秒(变性), 70℃ 30 秒(退火/延伸)。4. 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。
（二）、测序凝胶板的制备
1、玻璃板的处理：
银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。
（1）短玻璃板的处理
A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml 粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。
B. 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。
C. 4-5 分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程,每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。
[注意] 1. 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附。
2. 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。
3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。
(2)、长玻璃板的处理
A. 用浸透Sigmacote 溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。
B. 5-10 分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote 溶液。
[注意]
1. 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH 浸泡后除去。为防止交叉污染,
用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松驰。
2、凝胶的制备：
（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote 处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2mm 或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。
（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis
和10×TBE 缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm
的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED
和过硫酸铵。一般在胶灌制后4-6 分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED 和过硫酸铵。
凝胶终浓度
3 4 5 6 8 12 16 18
尿素42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0
Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0
10×TBE 缓冲液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
双蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0
10%过硫酸铵(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7
TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40
(3)胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。
[注意] 1、使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。
2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。
