快速分析盐酸胃复安制剂中的杂质
图1. 从Agilent 1200系列LC系统到Agilent 1290 Infinity LC系统的方法转换。
本文对Agilent 1290 Infinity液相色谱系统用于测定盐酸胃复安药物制剂中的杂质和有关物质的性能进行了评价。1200系列HPLC系统上的常规LC方法很容易转换为Agilent 1290 Infinity LC系统上的超高压方法，温度精确调节是使不同杂质得到相同选择性的关键参数。在此方法开发过程中施加的压力高达1070 bar。最终的高效方法在880 bar下操作，分析时间为3.5min，比原来的HPLC方法快4倍左右，且具有同样的准确度。验证研究证明了Agilent 1290 Infinity LC系统的性能。采用新的二极管阵列检测器（DAD）使杂质的检测限低至相当于主化合物的0.001% w/w，比要求的检测限还要低一个数量级。
目前药物分析的关键词是高通量、高效率和高分离度。高效率的目标就是在所开发和验证方法的准确度、精密度和重现性保持不变的前提下，开发比当前所用方法约快4~5倍的分析方法。在液相色谱（LC）中，加快分析速度的方法包括使用填料粒度小于2μm的色谱柱和/或在高温下操作。采用填料粒度小于2 μm 的色谱柱，与常规方法相比，可以在更高的线性流速下操作，但需要专用的LC仪器。
我们用Agilent 1290 Infinity LC系统测定了盐酸胃复安制剂中的杂质。该系统配置了高压泵，输液压力高达1200 bar，以及新的快速而灵敏的二极管阵列检测器（DAD）。方法开发包括从配置填充3.5μm 填料色谱柱的常规仪器（Agilent 1200 系列LC系统），向配置1.7μm填料色谱柱的UHPLC 系统（Agilent 1290 Infinity LC系统）上的条件转换。通过比较两个系统得到的数据，对各系统准确度、精密度和重现性进行了评价。
图2.摩擦热的生成对色谱柱选择性的影响以及降低柱温的效果。
实验部分
仪器、试剂与材料
标准Agilent 1200 系列HPLC 系统和Agilent 1290 Infinity LC系统。
图3. 用最终的Agilent 1290 Infinity LC系统方法得到的结果。
试剂与材料
杂质和有关物质的储备溶液用甲醇配制,储备溶液与水混合并稀释成适当浓度。制剂是盐酸胃复安水溶液（5mg/ml）与某些其它物质（保密配方）混合制成的注射剂。
图4. 制剂（上图）及添加了LOD浓度水平杂质1到9的制剂（中图：0.001% w/w；下图：0.005% w/w）。条件见图3。
结果与讨论
LC与1290 Infinity LC系统的方法转换
原来的方法是在使用四元泵带线性分离的1200 系列HPLC 上开发的。制剂添加了0.5% w/w 的色谱图如图1A所示。使用的色谱柱是XBridge C-18 柱，填充3.5μm粒度填料，初始压力为140 bar。只要将某些仪器的差异考虑进去，该方法可以轻松转换到1290 Infinity LC系统上。如果将方法参数直接拷贝到1290 Infinity LC系统上，保留时间将明显缩短。由于两个系统的延迟体积不同，选择性也发生了改变。四元泵的延迟体积是950μl，而1290 Infinity 二元泵的延迟体积已减少到了10 μl。我们在1290 Infinity LC 方法中引入了一段初始等梯度持续时间来补偿这一差异。经过这种直接修正，两个系统的保留时间和选择性非常相似，而1290 Infinity LC 的效率比1200 系列更高（未显示色谱图）。
然后将方法转换到填充1.7μm填料的内径为2.1mm 的BEH C18 柱上。为了保持两个柱子上的线速度相同，将流速减小到0.22 ml/min，同时将进样量从2μl减少到0.8μl，压力为380bar。为了补偿延迟体积的差异，在梯度中引入了0.5min的初始持续时间。这些条件下的结果与用3.5μm 填料色谱柱非常相似（图1B），但得到结果（图1A）的速度稍快。
使用1290 Infinity LC设置，柱效和分离度明显提高。理论塔板数可以用柱长与2倍粒径之比进行粗略计算。因此，1.7μm 填料柱的柱效应为3.5μm 柱的两倍。由于分离度与柱效的平方根成正比，所以，在同一系统上分离度应提高1.4 倍。在这个特例中，分离度的提高比理论预计高得多（例如峰1和峰2的分离度从2.6提高到5.9）。这归功于Agilent 1290 Infinity LC系统更低的死体积和更卓越的泵驱动。
1290 Infinity LC系统提高分析速度
在1.7μm粒度色谱柱进行分析时压力是380 bar，远远低于1290 Infinity LC系统泵的1200 bar的压力上限。因此，还可以通过增大流速来缩短分析时间。当增大流速时，为了保持相同的洗脱曲线，应按流速的增加比例缩短梯度时间。
当流速从0.22ml/min加快到0.66 ml/min时，操作压力从380 bar增加到了1020 bar。正如预期的一样，色谱柱在非常高的压力或高流动相线速度条件下，产生了摩擦热。由于分析物中某些组分的保留与温度有关，所以我们注意到，在高流速下色谱柱的选择性有所不同。可以看出，主成分和化合物5之间、化合物7 和8的分离度尤其受温度变化的影响（图2A）。
将柱温从37℃降低到32℃，可以抵消热效应（图2B）。在该条件下，在4.5~5min内就可实现良好分离，与原来的LC相比，时间缩短了3 倍。然而当压力增加到1070 bar时，所用色谱柱却只能耐受1000 bar 的压力。色谱柱在比最大耐受压力更高的压力下使用更长时间后，柱寿命和方法的耐用性会明显降低。
因此，对于常规应用，若柱长从150 mm减少到100 mm，在0.66 ml/min 流速下形成的最大反压为880 bar。进一步缩短梯度持续时间和梯度时间来保持原方法的选择性。该方法总分析时间是3.5min，而原来用3.5μm 粒度色谱柱时总分析时间为15.5min（图3）。初始峰的分离度是3.8，这仍比用1200 系列LC系统得到的数值高。
方法验证
采用图3的条件，测定了线性、进样重现性和检测限（表4）等参数。得到良好的线性（所有化合物均大于0.999）和进样精度。RSD 在0.005% 左右，接近检测限（LOD）的某些化合物的RSD 均低于8%，大多数化合物的RSD 低于3.5%。这都在该浓度水平的合格限内。在LOD 分析的色谱图见图4。LOD 相对于主要化合物（柱上50–250 pg）， 在0.001% w/w 到0.005% w/w 之间波动。这说明，杂质水平低于报告阈值10 到50 倍时仍可被检测到。
结论
本应用报告证明了将现有HPLC方法转换为Agilent 1290 Infinity LC系统方法的可行性。开始，我们将在1200 系列LC上建立的HPLC 分析方法简单移植至1290 Infinity LC系统上。如果考虑了某些仪器特征，该方法转移将相对简单。然后把原来的色谱柱（150 mm × 3.0mm，3.5μm 粒度）换成粒度更小的（1.7μm）窄内径（2.1mm）柱。此转换使化合物之间的分离度显著增加。使用小于2 μm 填料的色谱柱可以通过提高流动相的线速度缩短分析时间，而且不会影响分离度。在高压和高流动相流速条件下产生的摩擦热改变了方法的选择性。为了维持原来的选择性，将色谱柱温度的设置降低。
最终的Agilent 1290 Infinity LC系统分析是在100mm柱上进行的，压力为880 bar，比原来的HPLC 方法快4倍。该Agilent 1290 Infinity LC系统方法已得到成功验证。检测限随着相当于柱上50~250 pg 的主化合物在0.001%w/w 到0.005%w/w 之间变化，这比要求的报告浓度水平低10~50倍。
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综述
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标准
