卢西坦棒孢和暗褐毛壳菌所致少见皮肤感染病例分析
患者为来自四川的一名1岁半男孩。6天前，患者因瘙痒抓破了左侧下眼睑近内眦处皮肤。1天后局部出现红肿，患儿就诊于眼科，考虑蜂窝组织炎和急性结膜炎。给予妥布霉素眼液滴眼（每天四次）、莫匹罗星软膏外涂，并肌注青霉素80万单位/天（共3天）。然而，患者皮损炎症进一步加重，肿胀和分泌物更加明显。患儿平时喜在地上玩耍，无遗传及重大疾病家族史。无药物过敏史。查体：体温37.8℃，整个左侧上下眼睑充血、肿胀、睁眼困难。近内眦处皮肤可见稀薄分泌物及黄褐色结痂（图1a，略）。因明显触痛，患儿哭闹并拒绝进一步触摸。眼科裂隙灯检查提示角膜未受累、结膜充血。
由于患儿哭闹不配合以及家属担心损伤眼睛，我们仅取得少量标本用于真菌镜检、培养和扫描电镜。标本接种于含氯霉素和放线菌酮的沙堡培养基（SDA）和马铃薯琼脂培养基（PDA），以及血琼脂平板。可能由于标本的原因，直接镜检并未发现菌丝或孢子，但随后在扫描电镜下发现了菌丝和孢子结构（图2，略）。在PDA和SDA上27℃培养5天后，在接种点都长出了乳白色菌落，但都没有霉菌样菌落生长（图3a，略）。挑取酵母菌落镜下可见圆形、厚壁孢子，转种至科马嘉显色培养基，25℃培养2天后可见淡紫色显色（图3b，略）。血琼脂平板37℃培养12天后未见细菌菌落生长，但在接种点长出黑色菌落（图4a，略）。取菌落镜下观察，可见细长菌丝和孢子。再转种至不含放线菌酮的PDA和SDA上32℃培养7天后，可见白色气生菌丝和黑色子囊壳，菌落背面颜色呈琥珀色（图4b，略）。该菌落在麦芽琼脂培养基上生长更为迅速。根据该菌的镜下形态学特点（图4c、d，略）和文献上的结构描述，此霉菌样菌落被鉴定为暗褐毛壳菌。
患者在接受了3天的抗真菌治疗后复诊，皮损已明显好转。再次取皮损进行培养，但在PDA和SDA（含有及未含有放线菌酮）上均未见菌落生长。
针对ITS区和28SrDNA的D1/D2区进行真菌通用引物扩增，酵母菌落鉴定为卢西坦棒孢（与CBS 1944 (No. AY493434.1) 和EXOC34 (No. AY894824.1)同源性分别为99%和100%）。但对霉菌样菌落进行ITS区测序，与暗褐毛壳菌的同源相似性仅为88%（No. EF540753.1），考虑与暗褐毛壳菌提交在GenBank上的DNA数据较少有关，但结合形态学鉴定，可证实该霉菌样菌落为暗褐毛壳菌。该两种菌在GenBank上的登录号分别为FJ595482, FJ595483，且暗褐毛壳菌同时也保存于荷兰真菌生物多样性中心（CBS123816）。
我们利用半定量Api-Zym系统分别对这两株菌进行了酶活性检测。从培养2天后的SDA斜面上采集菌落制成菌悬液，取65μl加入含有不同酶底物的凹盘内，37℃下孵育4小时。利用β-糖苷酶作为质量控制，灭活微生物作为阴性对照。根据颜色变化程度，由两名实验者分别独立判断，并重复实验一次已保证稳定性和准确性。结果显示，部分酶仅在其中一种菌上出现，如N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和β-葡糖苷酶仅出现在暗褐毛壳菌，酸性磷酸酶仅出现在卢西坦棒孢（表1）。同时对两株菌进行了药敏试验，结果显示暗褐毛壳菌对伊曲康唑、酮康唑、咪康唑敏感，对氟康唑不敏感，对5-氟胞嘧啶耐药。对卢西坦棒孢敏感的药物是酮康唑、咪康唑、氟康唑，对5-氟胞嘧啶仍是耐药（表2，略）。
当时由于患儿的情况紧急，在采集标本后我们立即给予治疗。根据患儿对抗细菌治疗无效且镜下见到可疑菌丝结构，我们给与伊曲康唑胶囊口服（50mg/天，共7天；接下来隔日50mg，共8天），并嘱患儿家属每天8次外用3%氟康唑溶液冲洗眼睛。在初步诊断及治疗后，多个培养上长出的酵母和霉菌样菌落证实了我们的真菌感染诊断。对卢西坦棒孢和暗褐毛壳菌的微观和宏观形态鉴定也表明我们选择伊曲康唑口服和氟康唑外用的正确，因此治疗继续进行。患儿接受了总量600mg的伊曲康唑口服治疗，最终痊愈（图1b，略）。随访1年，未见复发。
除了常见的条件致病真菌，如念珠菌、曲霉、新生隐球菌和镰刀菌，一些少见的真菌也被发现可引起人感染，甚至在免疫缺陷人群导致严重感染。其中，毛壳菌和卢西坦棒孢少见引起人感染，尤其皮肤感染，迄今为止，这两种菌所致感染的报道都是深部真菌感染。卢西坦棒孢，即葡萄牙念珠菌的有性期，可导致约1%的念珠菌侵袭性感染和念珠菌血症的。葡萄牙念珠菌所致的播散性念珠菌血症因为对治疗反映欠佳，可导致严重后果。在骨髓移植或癌症患者可出现爆发性真菌血症，尤其是在对癌症患者过度使用抗真菌预防治疗的时候。葡萄牙念珠菌对两性霉素b耐药是临床上值得关注的事情，不过与氟康唑或其他抗真菌药如5-氟胞嘧啶联用可获得改善。毛壳菌属包含80多种，绝大多数的适宜生长温度为25℃到35℃。从临床标本分离的毛壳菌多被认为是空气孢子播散导致的污染，确定为人类感染病原体的报道非常少，自1980年以来报道的大概有20余例。在所有的死亡病例里，该菌都是在患者死亡后才分离鉴定出来，这意味着常规真菌学方法对该菌鉴定存在困难。Guarro和Serena等对毛壳菌的体外药敏试验显示其对氟康唑和氟胞嘧啶耐药，酮康唑、伊曲康唑和咪康唑有抑菌活性，但没有一种药具有杀菌活性，包括两性霉素b。目前还没有针对毛壳菌感染的很好治疗方案，这也可能是毛壳菌侵袭感染高死亡率的原因。
我们的案例是一个眼周的严重皮肤感染，由于患儿的特殊情况以及眼部取材的特殊性，通过直接镜检并未明确找到菌丝或孢子结构。基于患儿抗细菌治疗无效和可疑的镜下菌丝形态，我们给与了伊曲康唑和氟康唑治疗，并且该方案被随后的病原菌鉴定和疗效所证实肯定。由于患儿本身情况，我们无法进行病理活检，在抗真菌治疗后第二次培养也未有菌落生长，但是抗真菌治疗疗效、分子测序和形态学鉴定都表明这是一个混合真菌感染。毛壳菌属被认为是致病菌，因为在血琼脂平板上接种划线处并没有其他微生物生长。扫描电镜下能在眼周痂壳标本内发现菌丝，也表明毛壳菌并非来自环境污染。至于在PDA和SDA上未生长，可能因为培养基所含放线菌酮，可抑制毛壳菌的生长。
胞外磷脂酶、β-葡糖苷酶和氨基葡糖苷酶具有如溶解细胞质的活性，被认为是一些动物病原真菌的毒力因子。不过，关于卢西坦棒孢和暗褐毛壳菌分泌的酶及其在致病中的作用知之甚少。多种酶的活性可能与其发病机制有关，对多种底物进行消化以供给微生物营养，从而导致宿主的组织如皮肤产生损伤。由表1可见，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和β-葡糖苷酶仅出现在暗褐毛壳菌，酸性磷酸酶仅出现在卢西坦棒孢，这些酶都是发病机制中的重要毒力因子。这种各自独有的活性酶的存在也表明卢西坦棒孢和暗褐毛壳菌均参与了本病例的感染过程。环境霉菌的毒力因子不仅包括酶活性，也与喜温生长有关，这也可解释为何暗褐毛壳菌在27℃不易生长，而在32℃或37℃下生长良好。多数低致病性环境真菌，包括许多毛壳菌，都在22℃~25℃下生长良好。
本病例临床治愈，且随访未复发。提醒临床认识到皮肤真菌感染可能性，尤其那些少见致病菌，否则可导致严重的皮肤问题。这在一些特殊人群，如儿童和免疫低下人群尤为重要。但是，对其临床诊断和治疗常常是一个挑战。为避免这类少见条件致病菌导致高发病率、致残率甚至死亡率，早发现和早治疗是非常重要的。
参考文献：（略）
