三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(12)
关于淘汰血清蛋白结碘测定
淘汰血清蛋白结合碘测定的原因及可替代的项目和方法
淘 汰 的 理 由
血清含有机碘和无机碘化物。有机碘约占总碘量的90％一95％，其绝大部分与蛋白质相结合，称为蛋白结合碘(PBI)。PBI包括：(1)激素性碘，指甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸（T3）所含碘。(2)不具有甲状腺激素活性的有机碘，指一碘酪氨酸、二碘酪氨酸和微量甲状腺球蛋白所含碘。因为PBI中的大部分为激素性碘(T4、T3)，所以测定PBI可反映甲状腺功能高低。但因PBI是间接反映血循环中甲状腺激素的水平，且操作繁复，其结果又受碘剂、汞剂、x线造影剂等影响，实验室空气中碘污染亦可干扰实验结果。60年代以来逐渐为直接测定血清甲状腺激素(T3、T4)所取代。
可 替 代 的 项 目
直接测定血清甲状腺激素的项目有血清总甲状腺素(TT4)、总三碘甲腺原氨酸(TT3)、游离甲状腺素(FT4)、游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、反三碘甲腺原氨酸(γT3)、甲状腺激素结合试验(125I- T3U试验)和游离甲状腺素指数(FT4I)。此外，为诊断甲状腺疾病，还需要测定血清促甲状腺激素(TSH)、甲状腺球蛋白抗体(TGAb)和抗微粒体抗体(TMAb)。现就主要项目分述如下。
一、血清总T4(TT4)测定
(一)原理
甲状腺素(T4)自甲状腺分泌进入循环血液，绝大部分迅速与血浆中甲状腺素结合球蛋白(TBG)、甲状腺素结合前清蛋白(TBPA)和清蛋白(Alb)相结合，仅0.04％呈游离状态发挥生理作用。由于游离T4(FT4)量极微，测量方法复杂昂贵，目前国内尚未广泛使用。血清总甲状腺素(TT4)是游离状态T4与结合状态T4的总和，大多数情况下，TT4与FT4浓度相平行，能用以反映甲状腺功能，甲亢时TT4升高，甲低时TT4降低。通常采用放射免疫分析(RIA)或竞争性蛋白质结合分析(CPBA)。RIA以抗甲状腺素抗体为特异性结合剂，CPBA则以人血清甲状腺素结合球蛋白为结合剂。RIA法较CPBA法灵敏度高。现在已有多种不同的T4RIA方法，主要的区别在于去除或阻断内源TBG的方法及分离结合和游离部分的方法不同。
(二)性能
1．了解各类甲状腺疾病的甲状腺功能，可为甲低与甲亢的诊断提供一定依据，而对甲低的诊断更有价值，对个别T4甲亢的诊断则有特殊意义。但血清TTd测定结果受血浆TBG容量的影响很大。当TBG容量增高(如家族性TBG增高症、妊娠、服用雌激素和避孕药等)或降低(如家族性TBG减少症、低蛋白血症、服用雄激素和糖类皮质激素等)时，结合T4相应增多或减少。故在上述情况下，TT，与FT，不相平行，TT4不能用以判断甲状腺功能。
2，血清T T4系新生儿甲低筛选的重要指标之一。由于目前国内TT4试剂盒已有纸片血滴法，方法简便，新生儿取血容易，且可邮寄，甚易推广。一般先测TT4，有问题时再进一步测血清促甲状腺激素(TSH)。
3．血清TT4测定可用於对甲亢或甲低病人治疗后的随访观察，判断其预后及治疗效果。在药物治疗时，或作为增减药物或停药的参考指标。
(三)操作方法
按试剂盒疏明书操作。现以两种常用的TT4、RIA试剂盒为例说明。
第一种；固相TT4试剂盒，即包被法。
1．试剂盒内容物的准备
（1）总T4抗体——包被试管：100支T4抗体包被聚丙烯试管包装在拉锁袋中。冷冻，防潮。打开后要仔细地重新封好，在2—8℃可稳定至袋上所标明的失效期。颜色：浅绿色。
(2)[125I]总T4：一瓶碘标记T4溶液，内含甲状腺素结合蛋白的阻断剂，每瓶105毫升。冷存。开封后，在2—8℃可稳定至少30天，或至瓶上所标明的失效期。颜色：红色。
(3)总T4标准品：一套六瓶分别标明A到F的标准品溶液。该溶液以处理过的人血清为基质。备用。零标准品A瓶中含有2.0毫升溶液。其余标准品B到F瓶中各含有1.0毫升。冷存。开盖后2—8℃可稳定至少30天：冷冻可延长标准品的使用期。如果有必要，可分瓶，以避免反复冻。
标准品的浓度分别为0、l、4、10、16和24μg／d1，相当于0、12．9、51．5、129、206和309nmol/L。以合适比例混合所给出的标准品溶液，可得到其它浓度的标准品。
2．分析步骤
(1)空白管：成对标号4支空白(未包被)12X75mm聚丙烯试管：T(总计数)和NSB(非特异结合)。
注：因为在该检测中，非特异结合很低，所以可舍去NSB管，而对结果的准确度没有影响。
(2)包被管：成对标号12支总T4抗体——包被试管，A (最大结合)、B到F成对标号其它总T4抗体——包被试管用以质控和病人样品的检测。
| 标准品 | µg/dl | nmol/L |
|---|---|---|
| A(MB) | 0 | 0 |
| B | 1 | 12.9 |
| C | 4 | 51.5 |
| D | 10 | 129 |
| E | 16 | 206 |
| F | 24 | 309 |
向NSB管和A管中，加入25μ1零标准品A。向其它标号试管中加入25μ1对应的标准品、质控和病人样品。切记，直接将溶液加到试管底部。
注：高值病人样品应使用零标准品稀释。
(3)向所有的试管中，加入1.0毫升[125I]总T4，振荡。
注：加样过程不得超过10分钟。取出总T，待计数。
(4)在37℃温育60分钟。
注：在水浴中进行。
(5)完全倾去溶液。
注：除去所有可见的液珠将大幅度提高精确度。使用泡沫倾倒架，除去所有试管中的内容物，使试管空干2—3分钟。然后在水纸上叩击试管，除去所有的液珠。
（6）在γ计数器上计数1分钟。
3．计算
为了从logit-log标准曲线上计算T4浓度。首先计算每对试管的1分钟平均净计数。
净计数＝平均CPM一平均NSB CPM
然后计算每对试管相对最大结合(MB)的百分结合率。A管的百分结合率为100％。
净计数
百分结合率＝-------------×100%
净MB计数
可舍去对非特异结合的校正使计算简化。当百分结合率直接由平均CPM计算时，最后得到的样品浓度与实际结果相同。
使用logit-log坐标纸，以百分结合率为纵坐标，T4浓度为 横坐标，对B到F标准品的检测结果作图。标准曲线近似为连 结5点的直线。未知样品的T4浓度，可通过内插法从这条直 线上估算出。
第二种：PEG法TT4试剂盒。
1．试剂内容及配制；
(1)125I-T4：红色，4—5μCi／22ml。含有巴比妥缓冲剂、ANS(8—苯胺—I—萘碘酸，阻断剂)和BSA。直接用于实验。
(2)抗T4血清：含有巴比妥缓冲剂、BSA、NaN3。使用时加入22ml蒸馏水，溶解后为兰色液体。放置10分钟后用于实验。
(3)l标准品：配制在去T4血清中。使用时分别加入500μ1蒸馏水，放置10分钟并轻轻旋转瓶子，使其充分溶解后方可用于实验；T4含量分别为0、20、40、80、160、240ng／m1。
(4)聚乙二醇(PEG)：含巴比妥缓冲剂，直接用于实验。
2．分析步骤
加样及测定程序见表1及其说明。
表1 TT4RIA操作顺序表（单位ul）
| 试管组 | T4标准 | 待测血样 | 125I-T4 | 抗T4血清 | 37℃温育45分钟 | PEG |
|---|---|---|---|---|---|---|
| T | - | - | 200 | - | - | |
| 标准 | 50 | - | 200 | 200 | 500 | |
| 样品 | - | 50 | 200 | 200 | 500 |
(1)试管编号：l一2号管为T管，用于测量总计数率；3—14号管分别加入T4标准溶液(浓度为0、20、40、80、160、240ng／m1)各50μ1(标准做双管)；15号管后加入待测血清50μ1。
(2)各管均加入125I - T4溶液200μ1，混合均匀。
(3)各管(除T管外)均加入抗T4血清溶液200μ1，混合均匀，在37℃温育45分钟。
(4)各管(除T管外)均加入PEG溶液500μ1，充分混匀后在离心机上以3500转／分转速离心15分钟。
(5)立即弃去上清液(除T管外)。
(6)测定T管及各管沉淀部分的放射性计数率。
3．结果计算
(1)以沉淀管计数率减去仪器本底计数率B0得B。以B为纵坐标，以T4标准浓度为横坐标，在直角坐标纸上画出标准曲线。待测样品的沉淀计数率减本底的计数率后在标准曲线上查出样品的T4含量。
(2)以B／B0X100为纵坐标，以T4标准浓度为横坐标，在半对数坐标纸上作标准曲线。待测样品B／B0X100在标准曲线上查出样品的T4含量。
标准（样品管）计数率－本底计数率
B／B0X100＝－－－－－－－－－－－－－－－－－×100%
零标准管计数率－本底计数率
以上两种计算方法均可使用。
4．操作注意事项
(1)操作须严格按照加样程序表进行。
(2)试剂盒全部试剂启封后均须在2—4℃贮存，使用期两周。
(3)所用试剂及待测血清应平衡至室温后使用。
(4)温育前必须充分摇匀，以保证介质均匀，温育温度为37℃。
(5)离心前必须充分摇匀，离心条件应一致。PEG法分离结合及游离抗原效果与PEG加入后放置时间有关；离心后应尽快将各反应管上清液吸出，避免放置过久沉淀物浮起，随上清液被弃去，影响测定结果。
（6)待测血清样品应在冰箱保存。若超过3天应分装成几小瓶，置一20℃保存，以避免使用时反复融冻。一20℃保存一个月的血清不影响测定结果。
(7)要注意抗体效价，该试剂盒的抗血清最高结合率在35％一75％均可使用。计算方法为，标准“0”管沉淀计数率减去仪器本底，再除以总T计数率，减去仪器本底。
(四)参考值
随所用的试剂盒、实验室条件及被测对象的不同，各实验室有一定的差异。多数实验室参考范围介于4一14dg／d1。儿童、少年及孕妇总T4浓度较成人略高，男女性别对TT4影响不大。
