三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(24)
二、其它Hb测定法
(一)分光光度法
虽HiCN以其简便、准确、稳定、易于质控等优点；成为国际推荐的标准法，但试剂的毒性，妨碍了该法的普及使用。近年来由于表面活性剂在临床检验中的广泛应用，屡有文献介绍新的测定法，在常规工作中作为HiCN替代方法。下面简单介绍几种常用的方法。
1．碱羟高铁血红素(AHD一575)法
原理
此法由Eander于1984提出。非离子化去垢剂碱性溶液(AHD试剂)能使血红素、血红蛋白及其衍生物全部转化为一种稳定碱性羟高铁血红素，在575nm处有一特征性的吸收峰。
试剂
本试验所用反应液可于下列配方中任选一种：
⑴TritonX-100 25g，加0.1mol／LNaOH至1000ml。
⑵皂素1g加0.lmol／LNaOH至1000ml。
⑶Brij一35 25g，0.1mol／LNaOH至1000ml。
操作
⑴取血20μl加到上述任何一种3ml反应液中，充分混和，静置3分钟。
⑵分光光度计(带宽应小于8nm)波长575nm处，吸收池光径1．0cm，以反应液调零，测定吸光度(A)。
计算
氯化血红素是一种稳定的化学结构已知的化合物，可用来在碱性羟高铁血红素法中标定血红蛋白，其摩尔吸光系数为6958。血红蛋白浓度在2.7一29.08／d1范围内，氯化血红索浓度与吸光度之间呈线性关系。
式中①64458是目前国际公认的血红蛋白分子量。
②4是一分子血红蛋白含有血红素的分子数
③151是血液稀释倍数。
氯化血红素虽然可以依靠商品供应或自制，但其纯度均不高，’前高纯度的氯化血红素又是AHD一575法标准化的先决条件，所以必须加以提纯。提纯方法不算困难，但较麻烦。此外，由于仪器差异，使用上述公式必须十分慎重。比较简便的方法就是用HiCN法标定血液标本的血红蛋白浓度后，再来绘制本试验的标准曲线。
2．叠氮高铁血红蛋白(HiN3)测定法
原理
红细胞溶解后释放的Hb被K3(Fe(CN)6)氧化成高铁血红蛋白，后者与叠氮钠反应，生成HiN3根据以HiCN法制作的标准曲线，求出Hb值。反应式为：
Hb＋K3[Fe(CN)6]→Hi
Hi＋NaN3→HiN3
试剂：NaN330mg，K3[Fe(CN)6200mg，Na2HPO4·12H2O800mg，KH2PO4140mg，加蒸馏水至100ml，再加TritonX-100lml。
方法
⑴准确吸取NaN3血红蛋白转化液应用液5ml，加入指血20μ1，充分混匀。
⑵3分钟后，以40nm，光径1.0nm，以试剂应用液或蒸馏水调零，测定标本吸光值“A”。
⑶与同样处理的已知HiCN法定值的血样比较或查标准曲线，即可得血红蛋白浓度。
标准曲线作法如下：取不同浓度抗凝血或血红蛋白溶液数份，分别用HiCN法和HiN3，法测定每管血红蛋白浓度和吸光度。以HiCN法测定Hb浓度为横坐标，以HiN3法测定吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。
注意事项
⑴有报导NaN3。管理不当易引起爆炸，故NaN3试剂应注意保存。
⑵虽HiCN与HiCN3，吸收光谱的吸收峰几乎是重合的，但为了严格实验标准，仍需绘制HiNs标准工作曲线，不可以其“A”值乘以367.7求得Hb含量。
（二）自动Hb测定仪法
目前，国内使用的自动Hb测定仪有两种形式，即分离式和组合式。前者是单机只进行Hb测定；后者是与其它血细胞项目的测量组合在一起，成为各种型号的血液分析仪(常称血球计数仪)。两者测试原理相同，均为在溶血剂作用下，红细胞溶解，释放的Hb与试剂中的某一成份形成衍生物，在540nm波长下进行测定。现将实验中要注意的几个问题说明如下。
1．近年来，国内引进了大量配有特殊溶血剂的血液分析仪。溶血剂一方面可以破坏红细胞使Hb释放，并与溶血剂中的其它成份反应，形成Hb衍生物，进行定量。另一方面则可悬浮血细胞以进行白细胞计数。由于各种溶血剂配方不同，转化的Hb衍生物也不同。图1是几种溶血剂转化Ⅲ液后的吸收光谱曲线。可以看出没有一条完全曲线符合HiCN。为了统一国内标准，所用仪器均需校正。仪器一旦校准，不得再调。
2．对白细胞总数明显增高的患者Hb测定时应注意有些淬血剂，特别是溴代十六烷基三甲胺，可使Hb转化液混浊而导致Hb铡定值明显升高。有人曾对无白细胞及全白细胞5000／mm3、10000／mm3、20000／mm3、30000／mm3、50000／mm3不同的Hb液用十六烷基测Hb并进行了离心前后比较；结果表明，白细胞在20000以上就可使Hb为15g的Hb液测定值长高1g％，30000时升高2g％，50000时升高3g％以上，但这些转化液离心后再测定，与无白细胞者无明显差异。实验表明；白细胞在20000以上时，Hb转化液离心后再测定，才能保证结果可靠。
3．Hb测定仪应定期校正Hb测定应用光电比色原理，随着使用时间延长，光源灯泡逐渐老化、衰变，而影响实验结果。Hb测定仪使用一段时间或维修后均应校正。
4．Hb测定仪流动池应定期清洗Hb仪流动池的定期清洗非常重要。如Erma PC603
图1 四种溶液血剂形成的Hb衍生物吸收光谱
血细胞计数仪的清洗步骤如下：将装有清洗剂的杯子只放在Hb管下(也就是外电极)，另一装有稀释剂的杯子放在小孔管下，按“起动”键，使清洗剂吸入流动池中。放置30分钟后，取下杯子，再按“起动”键，使空气进入逐动清洗剂，反复两次。然后再将含有稀释液的杯子放，在小孔管和Hb吸管下(同在一个杯中)，再按“起动”键两次后，仪器可正常使用。如清洗剂不能去污，可改用5％次氯酸钠。
三、各种b测定法的评价
前已述及，随着基础医学的发展，有各种不同的Hb测定报道，这些方法各有优缺点。HiCN法操作简便，结果稳定司靠，为目前国际统一的标准方法，但它也存在不足之处。此沽最大的缺点是KCN有毒，使用管理不当可造成严重后果。硫化血红蛋白转化问题也未解决。AHD575测定法的试剂简易，不含有毒成份，呈色稳定，可用氯化血红素作标准品，是较理想的分光光度计测定法。但该法反应产物最大吸收在575nm，540nm波长时为波谷，而自动Hb测量仪(分离式或组合式)检测系琉波丧均固定在540nm，限制了该法自动化的应用。1966年意大利学者Vanzitti从吸收光谱、线性、试剂稳定性和血红蛋白衍生物(HiCN、HiN3)的稳定性，毒性等方面全面评价了：HiCN、HiN3两种方法，结果显示HiCN、HiN3，在540—546nm时，吸收曲线重合；4—20g／d1范围，两法直线回归相关极佳，斜率为1．00。两试剂在4℃条件下均可保持一年不变质，但NaN3，的LD50仅是KCN的1／7，表3总结了两种方法结果的比值，显示两法系统误差极小。国内有人配制的HiN3参考液(HiCN定值)密封保存两年，光密度不变，是较好的常规工作替代法。但是，应指出HiN3，最大吸收峰542nm且峰较尖锐，使用该法时，应注意比色波长要较为精确。
表3 HiN3/HiCN测定结果比较
作者 | 比值 |
Vanzetti（1996） | 1．00 |
Van Assendelft rt.al（1968） | 0．996 |
Matsybara and shibata（1968） | 1．032 |
Fe rracin（1969） | 1．00 |
Vanzetti and Franzini（1970） | 1．013 |
目前，国内有些单位用2%十六烷基硫酸钠冰醋酸溶液作为溶血剂，进行白细胞和Hb的测定。此法形成Hb衍生物不稳定，所得Hb结果精确性和准确性均较差。国外多采用十六烷基硫酸钠、氰化钾及其它成份配伍制成商品溶血剂，同时测定白细胞（或分类）和Hb均取得较好的效果。
近来有些作者介绍了硼砂法、二乙基硫化氨基甲酸钠法、酸碱法等，笔者从回收率、变异系数、线性范围，对HbF、HbCO的转化，显色时间及稳定性和干扰因素等方面对这些方法进行了实验评价，结果表明，这些方法均能达到常规实验的要求，其中以硼砂法更为理想。
