三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(23)
关予淘汰血红蛋白血液硫酸铜比重试验和血红蛋白沙利氏目测法
淘汰血红蛋白血液硫酸铜比重试验、沙利氏目测法的原因及替代方法
血红蛋白(Hb)是红细胞的主要成份，具有与氧分子呈可逆性结合的功能，是人体内氧的运输和交换的主要载体。许多疾病的病理生理变化都涉及Hb质或量的改变。因此，选择一种简便、快速、准确的Hb测定法，对于贫血及其他造血系统疾病的诊断和治疗有着重要的意义。
自1875年Gower设计稀释溶血液目视比色法以来，血液学工作者对Hb测定进行的大量探讨，大致可分为四大类，即：（1）根据血液物理特性测Hb(比重法)：(2)根据Hb分子组成而设计的总Hb测定法(全血铁法)；(3)根据Hb有O2可逆性结合的特性测Hb(血气分析法)，和(4)根据Hb衍生物光谱特点进行的定量法。其中有些方法虽简单易行，但误差较大，随着技术的进步和研究的深入，逐渐被淘汰。惟其如此，此次卫生部令决定在国内淘汰硫酸铜比重血红蛋白测定法和沙利氏(Sahli)比色Hb测定法，并推荐氰化高铁法做为可替代的方法。
淘 汰 的 理 由
一、为什么淘汰血红蛋白硫酸铜比重测定法
硫酸铜比重法测量血红蛋白的实验原理是根据血液血红蛋白与比重的关系，将血液滴入己知比重的标准硫酸铜溶液内，观察血滴悬浮的情况，求出血红蛋白含量的近似值。不难看出，此法相当粗糙，很难得出精确的结果。其干扰因素很多，有自然因素，也有人为因素。例如：(1)硫酸铜含5个结晶水，易于风化和潮解，不易准确配成各种比重的溶液。(2)多次加入血液后，硫酸铜溶液的比重有所改变，影响沉淀的准确度。(3)滴入的血样包括血浆和有形成份(血细胞)两部分，血浆成份(如血脂、血浆蛋白)质和量的改变或血细胞病理性变化(红细胞的大小及其内在的Hb含量)均与比重有关。因此，单从全血比重角度推测Hb含量，有时会带来偏差。(4)需要严格掌握实验条件。不但要注意溶液配制时的温度，试验时标本与硫酸铜溶液温度也必须十分接近。有报告指出，在室温(22℃)的硫酸铜溶液不宜与刚从人体采出的血液(37℃)试验，这点在冬季尤为重要。另外，实验时也需严格的操作步骤(如加血样手法、高度、观察血滴动态变化情况)，这些条件直接影响实验的准确程度。由于这些不足，卫生部令废除此项实验。
二、为什么淘汰血红蛋白沙利氏比色测定法
1895年沙利氏刨用了酸化血红素法进行Hb的比色测定，在全世界应甩昂近百年，长期以来此法在临床检验中(特别是在基层医疗单位)起了很大作用。但随着技术的进步和研究工作的深入，其缺点亦日渐突出，现已不能满足日益发展的临床医学的需要。其主要缺点为：(1)不能转化生理或病理血液中全部的Hb，对碳氧血红蛋白，还原型血红蛋白转化很慢或转化不完全。(2)由于目视比色，个体观察的主观差异较大。(3)血红蛋白转化时间较长，5分钟转化88％，10分钟95％，2小时才基本转化完毕。(4)纶戋反应不明显，在接近或到达终点时，加入稀释液后颜色变化不明显。比色过程不易标准化，往往由于比色板颜色不一致而影响测定结果。(5)色板与转化液色调不一致，往往给实验带来误差。由于这些因素，此次部长令决定淘汰沙利氏Hb测定法。
替 代 方 法
一、氰化高铁血红蛋白(HiCN)测定法及其质量控制
为统一Hb测定方法，1966年国际血液学标准化委员会(1CSH)推荐氰化高铁血红蛋测定法(下称HiCN)作为国际Hb测定标准方法。1978年ICSH，国际临床化学联合会(1FCC)和世界病理学会联合会(WASP)发表的国际性文件中重申了HiCN法。1983年中华医学会临床检验分会桂林会议以来，HiCN法逐渐在国内普及，对Hb测定的标准化起了重要作用。下面着重介绍HiCN法及其有关问题。
（一）HiCN法的优点
HiCN法之所以被选为国际标准方法，是因其具备以下几个重要特点：(1)操作简单，稀释液(试剂)为单一试剂。(2)除SHb外，其余Hb衍生物均可很快地转为HiCN。(3)HiCN在540nm处吸收峰较宽，可用一般分光光度计或滤光板比色计进行测定。(4)显色快而稳定，因此HiCN液可制成在相当长时间(至少六年)内稳定性不变的标准液，这对进行质量控制工作极为有利。(5)可以通过分光光度法测定直接定值。
（二）实验原理
血红蛋白被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白(Hi)，后者与氰基结合成稳定的棕色氰化高铁血红蛋白(HiCN)。在规定的波长和液层厚度的条件下具有一定的吸光系数。因此，根据其吸光度，即可求得Hb浓度。其化学反应式为
Hb＋K3[Fe(CN)6]→Hi
Hi＋CN-→HiCN
(三)试剂
经典的HiCN法有二种常用试剂(又称为转化液)，其配方为：
Drabkin(都氏)液：称取K3[Fe(CN)6)200mg，KCN 50mg和NaHCO31g，加蒸馏水至1000ml。
Van Kampen—Zijlstra(文齐氏)液：K3[Fe(CN)6)200mg，KCN：50mg，KH2PO4l40mg，TritionX—100 0.5至lml，加蒸馏水至1000ml。
从以上配方可以看出，两种试剂基本成份一致，唯pH不同。都氏液含有NaHCO3，pH值8.5，远离病理性血清蛋白(大多属于优球蛋白)的等电点。因此，检查这些病人时不易产生混浊，但反应时间过长(多数40分钟)为其不足。相反，文齐氏液因其pH值(7.2士0.2)较低，反应较快，5分钟后即可比色，但因该液的pH值接近于病理性血清蛋白等电点，易产生混浊。目前国内外常用文齐氏液做为常规使用。
(四)操作方法
1．取指血20μl，加到5ml血红蛋白转化液中，混匀，静置5分钟。
2．用分光光度计(或581G光电比色计)测定。波长540nm(或581G绿色滤光板)，光径1cm，以蒸馏水或空白转化液调零，测定吸光度“A”。
3．如果使用符合WHO标准的分光光度计，则可根据测定吸光度“A”直接计算出血红蛋白浓度：
其中Aλ540HicN为测定管吸光度。64458为Hb分子量。64458／1000为lmmol／LHb溶液中含Hb克数。251为血液稀释倍数。
(五)有关NiCN测定应注意的问题
1．仪器问题
HiCN法优点之一，就是通过分光光度法可直接定值，即Hb(g／L)＝AX 367.7。但使用367.7，这个常数是有条件的，即所测吸光度的分光度计波长必须十分准确，540nm处单色光纯度高，吸收池光程为准确的lcm，稀释倍数为1：251，且测定结果的灵敏度高，线性好。因此，仪器的校正是测定中的关键，决定着测定结果的正确与否。校正分光光度计的方法很多。对于HiCN测定最有效、最简单的校正方法是用特殊的HiCN标准校正液，因为这种溶液有特殊的吸收光谱并可保持6年不变。因此，用同批号的标准液即可根据其光谱特性去校准仪器，又可用其稳定性来监测已校准的仪器。校正大致有以下几个步骤；
(1)波长：
因为标准液吸收峰为540nm，波谷为504nm，故可将校正液放在待测光度计中，从500至580nm分几个波段测量其吸光度值。如果所得吸光度值的最大吸收峰在540nm，证明仪器波长准确，否则调试仪器有关部分。但在实际工作中对波长偏差不太大的仪器，可采用“将错就错”的办法，即如用HiCN标，准液所得吸收光谱的最好吸收峰是535nm，说明该仪器的535nm，实际上是540nm，实际工作中即可用535nm进行测定。
(2)灵敏度：
在实际工作中，特别是基层单位，在无符合标准的分光光度计时，溅得的吸光度(A)往往偏低或偏高。因此不能直接按前文介绍的方法进行计算。但可用HiCN参考液，照一般生化法绘制标准工作曲线或按以下方法求出K值后计算。例如，用定值为50g／L、100g／L、150g／L和200g／L的HiCN参考液，在721型分光光度计上测得吸光度A分别为0.13、0.27、0.405、0.54，则可按下式求出吸光度血红蛋白换算常数(K)
然后根据测定管吸光度“A”，即可用AXK算出血红蛋白浓度。为方便起见，还可根据K值列出吸光度“A”和Hb(g／L)对照表。
(3)杂光；
从单色器到达检验器的除检测所要求的单色光以外，其他波长的光称为杂光。杂光水平通常以其贡献的能量与总能量之比的百分数表示。ICSH推荐的HiCN测定法中，规定吸收曲线中波峰(540nm)和波谷(504nm)吸光度之比为Q值，并可由Q值制定HiCN标准校正液的纯度。在分光光度计已严格校正且无杂光存在的情况下，若测得，Q之值为1．59一1.63，表明该HiCN标准校正液的纯度合格。但对纯度合格的HiCN标准校正液，杂光的存在可使其吸收光谱的Q值降低(杂光主要使波峰540nm的吸光度下降，而对波谷504nm的吸光度影响不大),故可根据纯度合格的HiCN标准校正液的Q值，了解仪器的杂光程度(表1)。
表1 纯度合格的HiCN标准校正液在不同杂光水平的Q值
| 杂光水平（%） | 1．5 | 1．9 | 6 | 12．5 | 20 |
| Q值 | 1．6 | 1．59 | 1．55 | 1．7 | 1．38 |
(4)线性：
在仪器性能测定时，常用一种在一定波长范围内，确知其服从Beer定律的有色物质配成不同浓度来检查仪器本身是否能如实反映浓度变化，这就是仪器的线性检查。Hb测定用的分光光度计线性也可用HiCN标准校正液来检查。方法是将已知浓度的HiCN液准确稀释成各种浓度，分别测定。然后以稀释液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，各点连线应为直线。如有个别点不在直线上，作图时应使直线通过尽量多的点，将不在直线上的点吸光度与所代表的浓度在直线上的吸光度、比较。一般规定Hb浓度100mg/L以上的点，两者之差不得超过2％(100mg／L以下的点，可适当放宽)。
(5)吸收池：
吸收池的厚度及透光性是影响实验的又—因素。厚度可用卡尺鉴定，若不是lcm，则测定结果应乘校正系数。透光度可用下述方举测定：溶解0．2mg伊文氏兰于100ml蒸馏水中，放入所有待测吸收池内，用一吸收池做标准，将仪器读数准确调到50％T(透光度。)，将其它吸收池逐一与标准池比较，透光度在50％T士0.5％内者为合格。读数时应反复交替测定标准池与待测池的透光度，尽量减少仪器漂移的影响。标记吸收池．的透光面，以便在以后应用中，使同一侧面向光源。
(6)血红蛋白吸管和稀释器的校正：
血红蛋白吸管，稀释器吸量准确与否直接影响1：251倍稀释度的准确性，也是产生实验系统误差的重要因素之一，定期校正，十分重要。血红蛋白吸管的校正，通常采用水银称重法。
将待校正吸管先用清洁液，蒸馏水，酒精乙醚清洁干燥，然后准确吸取AR级水银至刻度，在注入已称量的称量瓶中，在分析天平上称出水银重量，根据称量时的温度下水银的密度（表２）即可求出水银的试剂容量
表２ 水银密度与温度的关系（mg/μl）
| 温度个位数 | 温度℃＋位数 | |||
0 | 10 | 20 | 30 | |
0 | 13.5951 | 13.5704 | 13.5457 | 13.5212 |
1 | 13.5926 | 13.5679 | 13.5433 | 13.5187 |
2 | 13.5901 | 13.5654 | 13.5408 | 13.5163 |
3 | 13.5871 | 13.5630 | 13.5384 | 13.5138 |
4 | 13.5852 | 13.5605 | 13.5359 | 13.5114 |
5 | 135827 | 13.5580 | 13.5335 | 13.5091 |
6 | 13.5802 | 13.5556 | 13.5310 | 13.5065 |
7 | 13.5778 | 13.5531 | 13.5286 | 13.5041 |
8 | 13.5753 | 13.5407 | 13.5261 | 13.5061 |
9 | 13.5723 | 13.5482 | 13.5237 | 13.4992 |
待校正吸管实际容量（μl）=
举例：空瓶重21．325g，水银连瓶重21．599g室温20℃则：
即实际容量偏高1%
如容量误差不超过1％，即可使用，否则应废弃不用。
2．试剂问题
(1)测定某些含有病理性蛋白血液Hb时，试剂的处理前已述及。经典的HiCN法的试剂有两种：都氏液和文齐氏液。前者含NaHCO3，呈碱性，病理血液(肝硬变、白血病、肾病)加入后不易产生混浊，但需在15℃条件下40分钟后才使Hb完全转化成HiCN。文齐氏液虽显色快，但因是低离子强度溶液，且其pH值接近病理球蛋白的等电点而易产生混浊。围绕着? 上述问题许多学者做了深入的研究。Vanzitti发现产生混浊的蛋白属优球蛋白，其特点是溶解度低，在低离子强度溶液中易沉淀。正常人血浆在pH4．5—6．5环境中可发生混浊，而病理血清则在pH＞7．0条件下发生。进一步研究证实，如在试剂中加入NaCI以增加其离子强度，可抑制这种混浊发生。但Mafsufoara发现，在加入NaCI抑制沉定的同时，也改变了HiCN的Q值，以致影响了测定结果的准确性。为此可以通过调整KH2PO4的浓度，改变PH范围，使Q值仍保持在正常的1．59—1．63范围内。目前日本等国使用的松原试验，即基于此种原理制成，其配方为：K3[Fe(CN)6200mg加KCN50mg,加KH2PO4120mg，加NaCl 5g，加非离子表面活性剂0．5—1ml，加蒸馏水至1000ml。
(2)对碳氧血红蛋白(HbCO)转化问题：Berens等报道Hb-CO的存在，可影响测定结果，因为HbCO转化为HiCN缓慢，有时几个小时转化还不完全，且HbCO在540nm时的摩尔吸光系数比HiCN大32％。在吸烟者(血中HbCO浓度高达20％)或接触CO者测定Hb时，可使结果偏高。Taylor提出延长转化时间至3小时，或将试剂中K3(Fe(CN)6)浓度加大5倍，(可使转化时间缩短至5分钟)均可得到满意的结果
(3)试剂合格的指标：①外观应为淡黄色透明溶液，如有变混变绿现象，即应废去不用。②pH低于7．0时应进行调整，否则与Hb混合后可引起混浊，同时Hi不易与CN结合，而KCN易在酸性条件下以HCN形式逸出。③在波长540nm处，光径为lcm，以水作空白，试剂A＝0。④都氏液较稳定，4℃条件下可保存一年。文齐氏液不易长期保存，应放在棕色玻璃瓶中，于4℃冰箱内保存。
(4)对含KCN的商品试剂的使用：以上介绍的HiCN的操作。计算及注意的问题针对的是经典的HiCN(即血与文齐氏液或都氏液混合后的HiCN)，而非对所用的含KCN试剂都适? 用。已经证明，目前国内外出售的某些商品试剂虽含KCN，但实际产物并非HiCN。如有些商品试剂内含溴代十六烷，HCN及一些表面活性剂，该试剂与血液反应的产物吸收光谱特点与HiCN不同，此时结果计算就不能使用367．7这个常数。在仪器校正时更应注意此问题。
(5)注意事项：
①血红蛋白中，KCN为剧毒药品。虽然浓度较低，但在配制和保存过程中必须提高警惕，防止污染，严禁口吸。氰化钾必须按剧毒药品管理规定保管。比色后，废液可按每升加次氯酸钠液(即安替福民)约35ml比例混匀，敞开过夜，使CN-氧化成CO2和N2挥发，或水解成C032-和NH4＋，再排入下水道。
C1Oˉ＋CNˉ→CNOˉ＋C1ˉ
2CNOˉ＋3C1Oˉ＋2H2O→2CO2↑＋N2↑十3C1ˉ十2OHˉ
CNOˉ＋2H2O→CO32-＋NH4＋
②血红蛋白不能贮存在塑料瓶中，否则CNˉ下降，使结果偏低。
③分光光度计的波长、狭缝、杂光和比色杯光径，均应校正。
④标准曲线或K值应定期检查，校正。
3、质控物问题
(1)HiCN参考液是制备标准曲线，计算K值，校正仪器和其它测定方法的关键物质。ICSH已公布了制备方法和严格的规格。参考品规格如下：①波峰540土1nm。波谷504～502nm。②A540／A504应在1．59～1．63间。③A750＜0．002。④棕色容器保存，稳定期长，4℃下至少保存6年。⑤无菌试验(包括厌氧培养)阴性。⑥测定精度＜土1％。⑦定值由指定的多个参考实验室测定。
(2)开展室内质量控制是提高血红蛋白测定准确性重要环节。
目前采用的质控物有：
①全血质控物。可采用新鲜库血或静脉采血用ACD或CPD保养液抗凝，混匀后分装在紧塞小瓶中，储存4℃冰箱内。全血质控物血红蛋白和红细胞计数仅可稳定5周。
②半固定醛化红细胞。这是目前认为既可作血红蛋白又可作红细胞计数的质控物。可采用过期库存血(但不得超过30天)，储存在4℃环境中，保存期为50～60天。
③冻干全血。全血质控物经冰冻干燥后，保存时间较长。
④溶血液质控物是最常用的Hb测定质控物。取献血员抗凝血，用三倍量生理盐水洗涤3次，除去上清液及白细胞层，最后一次以3000r/min离心30分钟，倒去上清液，加其半量的蒸馏水，振摇30分钟，促使红细胞溶解。移入分液漏斗，加入1／5体积量的甲苯，振摇30分钟，除去红细胞膜和脂质。分离出清晰的溶血液，先用3号玻砂漏斗过滤，最后在无菌操作下用6号玻砂漏斗过滤，并分装在紧塞小瓶或安瓿内，储存于4℃冰箱中。该溶血液质控物较为稳定，可保存半年以上。
近年来，血红蛋白质控已在全国展开，需要生产大量的Hb质控液，Hb校正液。这些制品不但需要大量的人血为原料，也易造成某些血行传染病(如：乙、丙肝；艾滋病)的传播，因此有人以猪血代替人血用于Hb质控，实验表明收到了满意的结果。用猪血制备的HiCN液，‘吸收光谱完全符合ICSH颁布的标准。将猪Hb质控液用于不同的常规Hb方法，可得到与人血同样的结果。猪血来源容易，取血简单，价格低廉并具有人Hb同样的质控作用，是人Hb质控制品理想的代用品。
