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三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(18)

2021.4.26

关于淘汰黄疸指数及凡登白试验

淘汰黄疸指数及凡登白试验，采用血清总胆红素和直接胆红素测定

一、为什么淘汰黄疸指数及凡登白试验

　　黄疸指数是1919年Meu　l　engracht 提出跟据血清黄色深浅程度来判断血清胆红素水平的一种方法。规定血清黄色色度相当于1：10000的重铬酸钾溶液的色度为一个黄疸指数单位。用目视比色法，比较粗糙，受主观因素影响较大。同时由于胆红素与重铬酸钾色泽的差异、血脂及血清中色素，尤其胡罗卜素的干扰，使判断结果常有误差。虽然有人改用光电比色法，但由于重铬酸钾与胆红素的吸收光谱不同，结果相差很大。国际上已经淘汰此方法。卫生部临床检验中心血清总胆红素测定专题协作组于1984年推荐改良Jendrassik—Grof法（J—G法)测定血清总胆红素，1983年美国临床化学学会(AACC)胆红素标准委员会科研小组也推荐J－G法为测定胆红素的侯选参考方法。因此建议采用J—G法测定血清胆红素。近年来发展的特异性高的胆红素氧化酶法测定血清总胆红素，是一个有前途的测定方法，在有条件的实验室可以试用。

　　1983年Ehrlich利用重氮反应检测尿中胆红素。此后，这一反应一直用于血清胆红素测定。胆红素在血清中以结合和非结告两种形式存在。结合胆红素溶于水，能与重氮试剂直接作用生成紫红色偶氮胆红素，亦称直接胆红素。非结合胆红素不溶于水，只有在有机溶剂(作促进剂)中方能与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素。利用血清胆红素这一性质，对黄疸进行鉴别，此试验称凡登白(Van den Bergh)试验。血清与重氮试剂直接作用如出现紫红色，为凡登白直接反应阳性，表示结合胆红素增高：根据呈色反应的速度又分为直接即刻反应，直接延迟反应。不呈色者为直接阴性反应表示结合胆红素不增高。再加入有机试剂(为乙醇)后，如仍不呈色为间接反应阴性，如显红色为间接反应阳性，表示非结合胆红素增高。如直接试验阳性的标本加入有机试剂后，红色再加深为双相反应，表示血清中结合及非结合胆红素都增高。事实上在判读结果时标准很难一致。更重要的是重氮反应的速度受很多因素影响，如重氮试剂中的对氨基苯磺酸和亚硝酸盐浓度高时反应快，盐酸浓度高时反应慢。试剂配制的时间，血清中不同组分胆红素的比例对呈色速度都有影响，难以得到准确结果。同时实验结果对黄疽鉴别的意义亦不够明确。国际上早已废用，故应淘汰。用血清总胆红素及直接胆红素测定能更准确地反映血清胆红素的含量。

二、血清总胆红素和结合胆红素测定 (改良J—G法或称咖啡因法)

(一)原理

　　测定结合胆红素，血清与重氮苯磺酸混合，生成偶氮胆红素。在没有咖啡因—苯甲酸作促进剂的条件下，只有结合胆红素与重氮试剂作用。加入抗坏血酸(或叠氮钠)终止反应。继续加碱性酒石酸溶液和咖啡因试剂，pH增高使偶氮胆红素呈兰色，吸收峰续从585nm移至600nm，测定更敏感。

　　测定总胆红素时，血清先加入咖啡因试剂(促进剂)再加重氮苯磺酸。在反应时，血清结合及非结合胆红素同时与重氮试剂反应生成偶氮胆红素，在室温放置10分钟后加入抗坏血酸(或叠氮钠)、碱性酒石酸试剂及稀盐酸生成偶氮胆红素。在600nm下测吸光值。

(二)试剂：

1．咖啡因试剂

　　无水醋酸钠82g，苯甲酸钠75g，二乙胺四乙酸二钠(EDTA·Na₂)1g，溶于约500ml蒸馏水中。再加入咖啡因50g，搅拌至完全溶解(注：加入咖啡因后不能加热溶解)。然后加蒸馏水稀释至1000ml，混匀。用滤纸过滤，置棕色紧塞试剂瓶内，室温保存，可稳定6个月。

2．碱性酒石酸钠溶液

　　迅速称取氢氧化钠75g，酒石酸钠(Na₂C₄H₄0₆·2H₂0)263g，用蒸馏水溶解，待溶液变冷后，补足至100ml，混匀，置塑料瓶中室温保存，可稳定6个月。

3．5g／L亚硝酸钠溶液

　　称取亚硝酸钠0.5g，加蒸馏水溶解并稀释至lOOml，混匀。此液为储存液，置棕色紧塞试剂瓶中4℃保存，三个月内有效。若发现溶液呈淡黄色时，应废弃重配。

4．5g／L对氨基苯磺酸溶液

　　称取对氨基苯磺酸(NH₂C₈H₄SO₃H·H₂0)5 g，溶于约800 ml和5g／L蒸馏水中，加浓盐酸15ml，待完全溶解后，加蒸馏水至1000ml。

5．重氮试剂

　　临用前将5g／L亚硝酸钠溶液0.5ml和氨基苯磺酸溶液20ml，混合后使用。

6．5 g／L叠氮钠溶液

　　称取叠氮钠0.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。

7．342μmo／L(200mg／L)胆红素标准液。将胆红素纯品(注1)在真空干燥器干燥24小时后，精确称取20mg于称量瓶内，加入浓度为二甲亚砜4ml溶解，用玻棒搅拌呈混悬状，加入浓度为0.1mmol／L的Na₂CO₃溶液2ml使胆红素完全溶解，并倾入100ml容量瓶内，必要时用二甲亚砜冲洗附在称量瓶壁上的胆红素，缓缓加入经检验合格的稀释用血清(注2)约80ml，：边加边摇，但勿太用力以免产生气泡。再加入0.1mol／LHCl　2ml，最后加入稀释用血清至刻度，混匀，配成200mg／L胆红素标准液。整个配制过程应尽量避贮存容器用黑纸包裹，置4℃可保存三天。

　　[注1]配制胆红素标准液的纯品，其氯仿溶液摩尔吸光系数在60700±1600范围内。

　　[注2]稀释用血清可收集多份无溶血、无黄疽、无脂浊的新鲜人血清，混合，如有絮状混浊可用蔡氏滤器过滤，混合血清应达到下述条件：取血清1.0ml加新鲜配制生理盐水24.0ml稀释，置入光径为10mm比色杯内。用同一生理盐水校正吸光值为“0”，用波长414nm读取稀释的血清吸光值应<0.100，用波长460nm读吸光值应<0.040。

(三)操作

1．血清总胆红素及结合胆红素测定

　　取16X100mm试管，按表1加液操作

　　表1　血清胆红素测定操作步骤

加入物(ml)	总胆红素	结合胆红素	空白管
血清	0.2	0.2	0.2
咖啡因试剂	1.6	-	1.6
对氨基苯磺酸	-	-	0.4
重氮试剂	0.4	0.4	-
混匀,室温放置10分钟
叠氮钠溶液	0.05	0.05	0.05
碱性酒石酸溶液	1.2	1.2	1.2
咖啡因试剂	-	1.6	-

　　充分混匀，按血清总胆红素方法进行测定，每一浓度平行做三管，求其均值。每管还应减去稀释用混合血清的总胆红素吸光值，然后对相应的胆红素浓度作图，绘出校准曲线。

(四)参考值

　　血清总胆红素：5.1～17.1µmol／L(0.3～1.0mg／d1)
　血清结合胆红素　0～6µmol／L<0～0.35mg／d1)

　　惯用单位与法定单位的换算：
　　胆红素mg／d1＝胆红素µmol／L　×0．0585

(五)附注：

1．本法在10—37℃范围内测定，不受温度变化影响，两小时内呈色非常稳定。

2．本法的灵敏度高，蓝色偶氮胆红素摩尔吸光系数(ε)74380±866

3．轻度溶血（含血红蛋白≤1000mg／L时)对本法测定结果无影响，但溶血超过此范围时，可使结果偏低。

4．胆红素与重氮试剂作用的反应速度由很多因素决定。其中重氮试剂的两种溶液组分是一个重要因素。一般而言，对氨基苯磺酸和亚硝酸浓度增加，反应增快，盐酸浓度增加，反应变慢。

5．测定结合胆红素的反应时间不同可得到不同的结果，文献报导，反应一分钟的吸光值的结果有较大的误差。由于胆红素和重氮试剂作用是一个动态过程，不同时间比色，结果自然会有差异

6．叠氮钠能破坏重氮试剂，终止重氮反应，故不能用含有叠氮钠作防腐剂的质控血清，否则可使反应不完全，甚至不呈色。

三、酶法胆红素测定：

(一)原理

　　在酶法胆红素测定中，反应如下

　　　　　　　　　胆红素氧化物
　　胆红素+1/2O₂ ---------------→胆绿素＋H₀

　　胆绿素+O₂---→无色化合物

　　在460nm波长，吸光度的下降值(△A)与血清中胆红素浓度成正比。

(二)试剂

1．0.1mol／L　Tris缓冲液(pH8.2)

　　Tris 1.211g，胆酸钠172.3mg和SDS 432.6mg溶于约90ml蒸馏水中，在室温用lmol／LHCL调至pH 8.2，再加蒸馏水至100mL。此缓冲液含4mmol／L胆酸钠和15mmol／LSDS，置冰箱保存。

2．胆红素氧化酶　酶活力为25000U／L．

3．342μmol／L胆红素标准液　配法见改良J-G法测定。

(三)操作：

1．按表3加入相应试剂

　表3　酶法胆红素测定操作步骤

加入物	测定管	测定对照管	标准管	标准对照管
血清	0.05	0.05	-	-
Tris缓冲液	1.0	1.0	1.0	1.0
蒸馏水	-	0.5	-	0.5
胆红素氧化酶	0.05	-	0.05	-

　　加入胆红素氧化酶后立即混匀，各管置37℃水浴15分钟，用分光光度计，在波长460nm以蒸馏水调零，分别读取各管吸光度A_S，A_SN，A_E及A_EB。

2．计算：

　　测定管净吸光度△A_E＝A_EB—A_E
　　标准管净吸光度△A_S＝A_SS—A_S
　　　　　　　　　　　　　　　△A_E
　　血清总胆红素mmol／L＝------------×342
　　　　　　　　　　　　　　　△A_S
　　　　　　　　　　　　　　　△A_E
　　血清总胆红素mg／d1＝-------------×20
　　　　　　　　　　　　　　　△A_S