三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(32)
关于淘汰尿妊娠蟾蜍试验
淘汰尿妊娠蟾蜍试验及其替代项目
妊娠试验是临床检验工作中最常应用的检验项目之一，视代医学用实验室方法进行妊娠诊断已有六十多年的历史。从方法学进展分析，大致经历了三个阶段。1928年德国医师Aschkeim等以孕妇尿注入未熟的小白鼠皮下，第五天解剖观察其卵巢，发现有充血、滤泡形成、出血点及黄体，即表示妊娠皮应阳性。此法用于临床诊断，标志着第一阶段，即生物学妊娠诊断阶段的开始。在50年代，“青蛙”实验已成为诊断妊娠的重要常规实验手段。第二阶段是通过生物化学实验(如碘实验)进行妊娠的诊断。
基础医学的研究，发现以上这些实验都是由于孕妇尿中存在较多量的绒毛膜促性腺激素(HCG)，注射到动物体内而引起的生物效应。因此，研究的焦点放在如何通过尿中HCG的检测进行更灵敏的妊娠诊断，这是妊娠诊断的第三阶段。1960年Wide首先报告了免疫学测定法，标志着一般免疫学逆方法诊断妊娠阶段的开始。其后，此法发展很快，并不断改进。矿它简单、快速，迄今仍是我国常规检验中的主要方法。随着免疫学的进展，并为满足临床医疗及计划生育工作的需要，更灵蔽敷的免疫学方法已应用于HCG检测。80年代以来，放射免疫，单克隆抗体二点酶联免疫测定法相继问世，HCG检测水平达到501U／L以下，使实验方法进入了早早孕阶段。
淘汰雄蟾蜍或雄蛙试验的原因
妊娠妇女胎盘绒毛产生大量的HCG，释放入血，使血液中浓度升高。HCG的分子量较小(50000)，可通过肾小球从尿中排出。将可疑妊娠妇女的尿注入雄蟾蜍体内，尿中如含有大量的HCG，则可刺激该动物的间质细胞产生雄性激素，放出精子。几小时后，检查动物排泄物中有无精子。有精子即为妊娠试验阳性，否则为阻性。
青蛙实验虽取材容易，尤其适用于农村等基层医疗单位的使用，但也存在许多不足。①敏感性差，其检测HCG灵敏度仅为30001U／L。②动物的个体差异、动物本身强弱的程度、动物饲养的环境不同，实验环境以及实验温度(室温)均影响反应速度，造成假阴性结果。⑧实验手续繁杂，实验时间长达4至24小时。④过碱尿液可使动物致死，实验前要纠正尿液pH值。鉴于上述缺点，1991年卫生部18号令决定在我国废除该项实验。
替代的方法
一、胶乳凝集抑制试验(LAI试验)
（一）原理
HCG是一种糖蛋白，作为抗原注入家兔体内，可使其产生相应抗体(抗HCG血清)。当这种抗体与抗原扣遇时即可产生免疫反应，但这种反应不能为肉眼所见。用化学方法将HCG交联在聚苯乙烯胶乳颗粒上，成为HCG胶乳抗原。当此抗原与抗HCG抗体结合时，就能见到胶乳颗粒的凝集。
孕妇尿中HCG含量增高，与相应量的抗血清(HCG)抗体充分作用后，因抗体已被结合，再加入HCG胶乳后，本该凝集的试验受到抑制，则不发生凝集反应，仍呈均匀乳状液。说明尿中HCG含量高，为妊娠免疫试验阳性。非孕妇尿中因含HCG极低，不足与抗HCG血清完全作用，故当加入HCG胶乳时，则可发生特异性凝集反应，成颗粒状沉淀。说明尿中HCG含量少，为妊娠免疫试验阴性。
（二）试剂与器材?
１、妊娠诊断胶乳抗原? 呈均匀乳浊的外观(系吸附有绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯胶乳抗原)，用前摇匀。
２、妊娠诊断抗血清? 用HCG免疫家兔获得。
３、反应板? 系背面涂以黑漆，正面用红漆划分为若干个2．5×2．5cm方格的玻璃板。亦可用普通载玻片代替。
（三）操作
１、在特制黑色玻璃板的一个实验圈内，滴加被检尿一滴。
２、加抗HCG血清一滴，摇动玻片，充分混合30秒钟，促使抗HCG血清与尿中HCG抗原充分结合。
３、放置2～3分钟，再滴加胶乳抗原一滴，继续不断缓慢播动玻片2～3分钟。
４、在光线较强处的黑色背景下用肉眼观察结果，如不明显时亦可用显微镜观察。
（四）结果判断
如玻片内液体呈均匀乳状，混浊不透明，为无凝集现象，即妊娠试验阳性。如玻片内液体呈颗粒样凝集，且液体的均匀乳浊状态消失而有透明感，即为妊娠试验阴性反应。若出现非均匀——致的漂浮凝集为非特异性凝集，应将标本离心后重试，并查清原因。
（五）注意事项
应用清晨第一次尿，并要求标本新鲜，透明。
所用的胶乳抗原和抗血清必须是同一批号。更换试剂时必须与上一批试剂作阳性和阴性对照，其结果一致时方可采用。
尿液，抗血清和抗原，一定要按规定顺序加入，滴的大小要一致。
室温20℃时反应较好，温度太低反应缓慢，观察结果应延长1～5分钟。
严重蛋白尿、血尿、尿液含多量汞盐及严重细菌污染，均不宜作此试验。
试剂应保存于2℃～8℃冰箱。试验前先取出於室温放置，待其温度接近室温后再使用。注意不能再凝集。
每次试验均应作已知阳性，阴性和盐水对照，完全符合才能报告结果。
二、单克隆抗体二点酶免疫法
本法使用的试剂与器材有单克隆HCG酶结合抗体显色剂、聚苯乙烯小孔板。试验时在聚苯乙烯小孔板的小孔中加酶结合抗体溶液1滴，再立如加尿液标本1滴，混匀后置37℃20分钟，倒出小孔中溶液，用自来水洗涤6次，以纱布吸干。加显色剂2滴，5分钟后观察结果；显蓝色为阳性，无色为阴性。
此法测定的基本原理是在已包被有抗β-HCG抗体塑料小孔中，加入将酶标记抗α-HCG抗体及被测尿标本，如尿中含有HCG，其两端分别与以上抗α及β-HCG抗体结合，遇底物后结合于HCG上的抗体，酶促使底物显色。标本中若无HCG存在，就不能与单克隆抗体酶结合，在涤洗过程中即被洗脱。
单克隆抗体二点酶免疫法由于采用了一对HCG特异性抗体，所以特异性强，与HCG的同类激素如促甲状腺激素(TST)、促卵泡或熟激素(FSH)及促黄体生成激素(FSH)等无交叉反应。也不受尿中高蛋白，血液，高药物浓度的影响。而且敏感性高，在尿中含有，50 IU／L时即出现阳性反应。此浓度相当于受孕10天时孕妇尿中HCG之含量，故本法又被称为“早早孕试验”。由此可以看出，此法是很有前途的HCG检测方法。
三、酶联免疫测定法
此法与目前国内普遍采用的试剂盒不同点在于其设计，结构及选取的材料。该试剂反应体为一试管，试管顶端有两层膜。第一层为保护性滤膜，其作用可将尿液中蛋白杂质滤除。第二层为一张经抗一HCG抗体处理的反应膜。试管内充填优质吸附材料，可吸收过滤的尿液或血清样品。该试剂盒配备有下种试剂：试剂1为单克降抗β-HCG＋辣根过氧化物酶复合物；试剂2为酶的底物显色液。当尿液样品通过上层滤膜时，尿液中的抗HCG分子便可与膜上的抗一HCG抗体结合，加入试剂1后，抗体酶复合物通过滤膜和反应膜与膜表面上的HCG分子上的另一个暴露点呈特异性的结合。此时将滤膜剥开，加入试剂2使复合物着色，根据尿样中HCG值不等而m速显示出不同的颜色符号。该法的另一优点是，处理的膜上含有特殊形状的HCG带，作为检查实验中酶系统反应情况的标志，对控制结果的质量有重要作用。当抗体酶复合物或显色剂失效时，反应物不出现任何标记(点和杠均不出现)。有文献报告，此法灵敏度较高，准确性也很好，是开展检测早早孕、药物引产、人工流产理想的检测试剂。
RIA定量测定：如欲测得精确HCG定量结果，则需采用放射免疫(R1A)测定法。具体方法读者可参阅其他有关文献或著作。
四、妊娠实验的临床应用及方法选择
绒毛膜促性腺激素(HCG)的检测不仅对妊娠的诊断具有重要意义，而且对与妊娠相关疾病的诊断、鉴别和临床观察也具有十分重要的价值。
（一）在妊娠诊断方面的应用
１、首先，是用于早期诊断妊娠。妊娠时尿中HCG含量增高，一般孕后35～40天在25000IU／L以上，60，70天出现高峰，可达8000～320000IU／L，个别人甚至高至百万单位以上。常用HCG检测方法均能在妊娠35天时呈现阳性反应，阳性率达98%以上。一些灵敏度高的试验则可在更早期做出诊断。
２、有利于非计划妊娠的处理。使用酶联或RIA等方法可测出25天以内的早早孕。及时给予口服抗早孕药物再定期观察，若抗治无效，即可做人工流产。
３、对异常妊娠及妊娠有关情况的观察。宫外孕时，一般试验有60％的阳性率(子宫流血3天后仍可见血中HCG增高)，此点有助于与其他急腹症的鉴别。不完全流产者子宫内尚有胎盘组织存活时，妊娠试验仍可呈阳性。完全流产或死胎，可由阳性转为阴性。HCG在2500IU／L以下的孕妇，并有逐渐下降的趋势者，有流产或胎儿死亡的可能。当HCG降到600IU／L时则难免流产。在保胎治疗中，如尿HCG不断下降，表示保胎无效，反之如明显上升，说明保胎是成功的。在正常产后4天或人工流产后13天，血清HCG应低于1000IU／L；产后9天或人工流产后25天，血清HCG应恢复正常。否则，应考虑有异常可能。先兆流产时，尿中HCG含量正常则可不发生流产，即预后良好；如HCG低于1000IU／L，则发生流产的可能性大，治疗往往无效。多胎妊娠时，血及尿中HCG含量往往高于正常一胎妊娠。
４、可做为判定胎盘功能的依据。正常妊娠期，血清中HCG的变化呈双峰曲线，第一峰在妊娠?0天左右(80000IU／L)，100天后渐呈下降趋势，140～200天维持在低而稳的水平(6000～20001U／L)，至260天又出现第二高峰(26000IU／L，临产期又稍有下降。此种变化反映出正常妊娠时的胎盘功能状态。若在第一高峰期做血清HCG测定，其值在正常范周内，79％可妊娠足月，若低于正常范围，92％的妊娠失败。
（二）在滋养细胞肿瘤诊疗方面的应用
葡萄胎、恶性葡萄胎、绒毛膜癌及睾丸畸胎瘤等疾病的患者，尿中HCG显著增高，可达每升10万至数百万单位。应用稀释试验诊断可与正常妊娠鉴别。正常妊娠尿液一般经l：100稀释后即呈阴性反应，葡萄胎在1：200以上，稀释后常常仍为阳性。一般认为在妊娠12周以前，如稀释1：500仍呈阳性，妊娠12周以后稀释1：200以上仍呈阳性，则具有诊断价值。绒毛膜上皮癌等恶性肿瘤的分化程度不同，尿液HCG含量可相差较大，一般经l；100～1，500稀释仍呈阳性者，结合临床可做出诊断。在这些疾病手术或药物治疗后需连续进行尿液HCG测定，借以判断疗效，观察病情变化。滋养细胞肿瘤病人术后3周，尿中HCG应低于501U／L；8～12周应呈阴性。如仍呈阳性则揭示可能有残存瘤组织，潜在复发趋向，更需定期检查。葡萄胎应半年后检查一次；绒毛膜癌术后1—3个月检查一次，以后每半年复查一次(均用浓缩试验法)，以便及时发现恶变复发，利于及早治疗。
表1 几种检测HCG方法的比较
名称及缩写符号 | 灵敏度(IU/L) | 实验条件 | 应用价值 |
胶乳凝集抑制试验(LAT) | 2500 | 试剂易购得,方法简便,5min可完成 | 用于早孕诊断适合于一般医院广泛使用 |
红细胞凝集抑制试验(HAL) | 半定量1000 | 要求条件较高，需2h完成 | 使用于有条件的医院或一般科研应用 |
放射免疫试验（RIA） | 15 | 要求条件高1h可完成试验 | 同上 |
单克隆抗体体二点酶免疫法（β—HCG）又称早早孕试验 | 50 | 试剂要求条件高，1h可完成试验 | 适合做高灵敏度、特异性的检测，可与LH鉴别 |
上述有关HCG在临床中的应用，有的只是一般的定性实验，有的则要参考准确的HCG含量。临床医生可根据木同的实验目的，有的放矢地选择。几种HCG检测法特点见表1。
