三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(28)
二、连续溅定(速率)法测定
（一）速率法测定ALT
１、原理
在酶反应确定的条件下，血清中ALT和底物作用，产生丙酮酸。底物中的乳酸脱氢酶(LDH)和还原辅酶I(NADH)使丙酮酸还原成乳酸，同时还原辅酶I被氧化成辅酶I（NAD）。腐于还原辅酶I在340nm（严格讲是339nm）处有最大光吸收，因此伴随还原辅酶I不断被氧化的同时，A340。光吸收值随芬下降，下降速率和ALT活力成比例，籍此测定ALT活力。
2、测定方法
国际临床化学联合会(1FCC)的推荐方法：IFCC推荐法为大家公认。
该法的反应条件及试剂组成在反应时的真实际浓度为：
反应温度 30℃
pH 7.5
Trisc(三羟甲基氨基甲烷) 100mmol／L
NADH 0．18mmol／L
L—丙氨酸 500mmol／L
α-酮戊二酸 15mmol／L
LDH ≥1200Μ／L
磷酸吡哆醛* 0．11mmol／L
*国内试剂盒中多无此成分
本法要求血清和试剂的此例为1：12(1~p 0．083)。α-酮戊二酸须单独配制。反应时先将血清0．20ml和除α-酮戊二酸以外的底物液2．00ml混和，让血清中含有的内源性酮酸和基质发生还原反应，以减少或消除对测定ALT的干扰。然后再加Aa-酮戊二酸液0．20ml，开始酶反应。在迟缓反应时间约1．5分钟后，记录NADH在340nm的吸光值的下降速率，选取线性部份；计算酶活力值。
IFCC方法中加入了磷酸吡哆醛，使血清中谷丙转氨酶都在具有充分的辅基条件下参与反应。因此，该法测定结果较其它方法要高。
IFCC法的反应温度为30℃。这是指恒温反应槽中比色杯内溶液的实际温度，严格要求为30．0士0．01℃。
用分光光度计测定，其比色池光径为10mm时，按下列公式计算酶活力(Ｕ／L)。
式中6300为NADH在340nm，光径为10mm的摩尔吸光值。
（二）速率法测定AST
１、原理
连续测定的法测定AST反应为：
在340nm波长下，监测’NADH的氧化速度。即吸光值的下降速率，此速率与AST活性成正比。
２、测定方法
测定方法与测定ALT相同，所不同者仅底物溶液与参考浓度。现将IFCC法的底物溶液和参考浓度介绍如下：
底物溶液与参改浓度
pH 7.8
Tris缓冲液 80mmol／L
L-门冬氨酸 200mmol／L
α-酮戊二酸 12mmol／L
NADH 0.18mmol／L
磷酸吡哆醛* 0.1mmol／L
苹果酸脱氢酶 1660Μ／L
乳酸脱氢酶 2500Μ／L
*国内试剂盒中多数没有此成分。
３、附注
（1）连续监测法测定ALT及AST，在常规临床化验室中绝大多数使用市售的测定试剂盒，在．9动生化分析仪或半自动生化分析仪上进行。因此，在测定前需熟悉试剂盒的组分及浓度，严格按试剂盒的说明书使用试剂。同时要熟悉自动分析仪的操作，了解各种参数的意义，根据测定的原理设置各项参数。特别是当使用新试剂盒时，不能照搬原来的参数数据。设置好参数后，需经实验，结果与原测数据或定值质控血清结果一致时，方可使用。
（2）试剂盒使用中的注意点：按不同推荐方法制备的试剂盒内所含各组分常有不同。例如：不少试剂盒虽然标明为IFCC法，实际上组分中没有磷酸吡哆醛；有的用磷酸盐为缓冲液，有的内含乙二胺四乙酸(EDTA)等‘不同试剂盒要求反应的温度有25℃、30℃、37℃。有的试剂盒配成两种试剂，以α-酮戊二酸为酶反应开始试剂；有的为单一试剂，加入血清即开始酶反应。各种方法要求加入的血清和试剂比例亦不一样。因此要严格按说明书规定进行操作。按照试剂盒说明书介绍的使用方法，将高酶活力血清用缓冲液作不同倍数稀释，测定各稀释标本的酶活力应呈良好的线性。
（3）目前通用表示酶活力的国际单位定义为：在规定的反应条件下(温度、缓冲液组分、pH及底物浓度)，每毫升标本1分钟能催化lμmol底物或辅酶所含的酶量为1国际单位(IΜ)。但国际单位一词易被误解，认为不论在何国家，采用什么方法，只要IΜ相同，所代表的酶量是一样的，这显然不符合规定。为避免误解，现多删去“国际”两字，早用单位(Μ)一词：来表示。1978年IFCC建议体积单位用升而不用毫升，所以目”前酶的活力单位用Μ/L表示。
（4）底物液中含有还原辅酶I，初始的基质液于340nm的吸光值应在1．0A以上。很多试剂盒都有本身的规定，低于规定的光吸收值说明内含NADH过少或试剂失效，不能再用。
