三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(28)
关于淘汰血清丙氨酸及门冬氨酸氨基转移酶金氏法，酮体粉测定法
淘汰血清转氨酶测定的金氏比色法、酮体粉快速测定法的原因及替代方法
丙氨酸氨基转移酶(ALT，惯称谷丙转氨酶GPT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST，惯称谷草转氨酶)是临床上最常测定的两种氨基转移酶(惯称转氨酶)。目前国内测定转氨酶的方法有两大类：
1、连续测定(速率)法：这种方法以反应液中还原辅酶I(NADH)每分钟被氧化的微摩尔数为酶的活力单位(Μ／L)进行监测，结果准确，是公认的较好测定方法。但需要自动生化分析仪或合乎要求的分光光度计。
2、比色法(固定时间法)：ALT催化丙氨酸、AST催化门冬氨酸的氨基移换反应，并分别生成丙酮酸和草酰乙酸，后二者能与2、4—二硝基苯肼作用，进行比色测定。此二法不需要特殊的仪器，试剂较廉，且容易获得为其优点。但比色法有其固有的不足?国际上现多不采用。考虑到我国的实际情况，卫生部1991年第18号令决定淘汰其中的金氏测定法和酮体粉摭速测定法。
淘 汰 的 理 由
一、为什么要淘汰金氏比色法
国内采用的血清转氨酶比色测定法基本上可分为赖氏（Reitman-Frankel）法和金氏(King)法。这两种方法的原理，试剂和操作步骤大同小异。在酶作用时间上，金氏法为60分钟；犊氏法测定ALT为30分钟，测定AST为60分钟。两种方法的主要不同点在于单位定义和标准曲线绘制方法不同，因此测定结果的单位数值不同。测定ALT和AST的原理和方法基本相同，只是ALT用丙氨酸作底物，AST用门冬氨酸作底物，以下仅以ALT测定为例说明之。
1、ALT比色法的反应原理
利用在等摩尔条件下丙酮酸苯腙较α-酮戊二酸苯腙于480～530nm光吸收大三倍的特点进行比色测定。作用物(α-酮戊二酸)和生成物(丙酮酸)都可生成最终呈色的苯腙，这说明测定反应本身存在固有的缺陷。
2、底物中。—酮戊二酸量过少，严重影响酶活力测定α-酮戊二酸亦和2.4二硝基苯肼反应形成苯腙，干扰丙酮酸的测定。比色法中的。—酮戊二酸浓度为2mmol／Ｌ，反应时浓度为1.6mmol／L，试剂空白读数约0.26A(520nm)。根据酶反应最佳条件计算，α酮戊二酸浓度至少应为15mmol／Ｌ，则试剂空白值增加10倍，实际已完全无法测定酶反应产生的丙酮酸。所以，在建立比色测定法时，只能大大减少α-酮戊二酸用量，以致反应不能满足酶活力测定的要求，使酶反应产生的丙酮酸量和酶活力间不能呈良好线性关系。
3、2.4—二硝基苯肼用量不足，使显色反应的工作曲。线弯曲为降低空白读数，反应时不得不使用较低的2.4二硝基苯肼浓度，以致使显色反应的工作曲线弯曲。以上三点是比色测定法的固有缺陷，除此而外，金氏法更有其更突出的缺点.
4、金氏法测定转氨酶活力定义为：100ml以血清在37℃和底物反应1小时产生lmmol／L丙酮酸为1个单位，写作1Μ／100ml。由於反应时间延长至1小时，使本来浓度不足的底物在与酶较长时间反应后，酶活力和反应产生的丙酮酸量更不呈直线关系，酶活力超过300Μ／100ml的标本必须将血清稀释后再测定。金氏本人于60年代已发表文章，说明自己的方法不能准确反映酶活力，不宜推广使用。事实上，国际上早已废用金氏的比色法。
二、为什么要淘汰酮体粉快速测定法
酮体粉快速测定法，亦属比色法。是以含亚硝基铁氰化钠、无水碳酸钠和碳酸铵的混合物，惯称酮体粉。与ALT催化反应底物生成的丙酮酸作用，生成兰色化合物，从色泽的深浅来判断ALT的活性。此法没有严格的测定条件，干扰因素较多，判断结果的酮体反应是一个定性反应，不符合测定酶活力媳条件，误差较大。目前采用的单位很少，实际上已废用，卫生部已命令淘汰。
替 代 项 目
一、赖式比色法
赖氏法并没有自己的酶活为单位定义。作者以当时卡门氏的速率法为准，测得多份不同ALT活力血清的ALT卡门氏单位。然后在赖氏比色法条件下，测得各份血清反应显色的吸光收值。将每份血清的卡门氏单位和对应比色法吸光值在坐标纸上作图。经过大量实验，对所有实验点以最佳曲线拟合，形成了比色法在某指定比色计上的标准曲线。坐标横轴为卡门氏单位，纵轴为吸光值，比色法结果和卡门氏速率法结果一致。继后作者以底物溶液及丙酮酸标准溶液，按照酶反应实际情况配制成不同浓度的丙酮酸标准溶液系列与2．4二硝基苯肼显色，并与速率法的结果比较。经多年反复实验，最后作者正式报告可通用于各种比色计的结果为ALT28卡门单位的鼍清在比色法条件下产生相当于0．1μmol丙酮酸，ALT57卡门单位的血清产生相当于0．2μmol丙酮酸，ALT97卡门单位? 的血清产生相当于0．3μmol丙酮酸。这样就使赖氏法标准曲，线上丙酮酸量和对应卡门单位确定下来。1970年将曲线延伸至150卡门单位。赖氏法报告的结果与速率法结果一致。没有条件采用速率法的实验室可以采用此法。
（一）赖氏比色法测定血清ALT
1、试剂
（1）Imol／L磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠(含两个结晶水)17.6g溶解于水中，并加水至1000ml，冰箱内保存。
（2）0.1mol／L磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾13.6g溶解于水中，加水至1000ml，冰箱内保存。
（3） 0.1mol／l磷酸缓冲液(pH7.4)：将420ml 0.1ml／L磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol／L磷酸二氢钾溶液混匀，置冰箱内保存。
（4） 底物缓冲液(DL—丙氨酸200mmol／L，α-酮戊二酸2m—mol／L)：精确称取1.79g DL-丙氨酸和29．2mgα-酮戊二酸，先溶于约50ml 0.1mol／L磷酸缓冲液中，用lmol／L氢氧化钠(约0.5m1)调到pH7.4，再加磷酸缓冲液至100ml，置冰箱保存，可稳定两周。
底物中可加入麝香草酚(每升底物加0.9g)防腐，置冰箱中至少可保存一个月。分装安瓿灭菌后，室温至少可用3个月。
（5）lmmol/L 2.4二硝基苯肼溶液：称取19.8mg 2.4二硝基苯肼，溶解于100ml lmmol／L盐酸中，置室温保存。
（6）0.4mol／L氢氧化钠溶液：将16.0g氢氧化钠溶解于水中，并加水至1000ml，置带塞塑料试剂瓶内，室温可长期稳定。
（7）2mmol／L丙酮酸标准液；准确称取22.0mg丙酮酸钠（AR），置于100ml容量瓶中，加0.05mol／L硫酸至刻度。
丙酮酸不稳定，容器开封后易聚合生成多聚丙酮酸，故宜使用可靠的市售丙酮酸标准液。
2．操作：
在测定前将底物在37℃水浴中预温5分钟，然后按表1操作。
表1 ALT赖式法测定操作步骤
| 加入物 | 测定管 | 对照管 |
血清（ml） | 0.1 | 0.1 |
底物溶液（ml） | 0.5 | — |
混均后，在37℃水浴箱中保温30分钟 | ||
2.4二硝基苯肼（ml） | 0.5 | 0.5 |
底物溶液（ml） | — | 0.5 |
混均后，在37℃水浴箱中保温20分钟 | ||
0.4mol/L氢氧化钠溶液（ml） | 5.0 | 5.0 |
在505nm以蒸馏水调零点，读取各管的吸光值。测定管吸光值减去对照管吸光值后，从标准曲线查得ALT活力单位。 |
3、标准曲线绘制
（1）按表2顺序加液，制备AIT测定标准管
（2）各管加入2．4-二硝基苯肼溶液0．5ml，混匀，37℃保温20分钟后，加入0．4mol／L氢氧化钠溶液5．0ml。
（3）均匀，放置10分钟后：在505nm比色：以蒸馏水调零，读取各管吸光度。各管吸光值减去“o”管吸光值，所得差值
表2 赖式法测定ALT标准曲线的操作步骤
加入物 | 管 号 | ||||
4 | 0 | 1 | 2 | 3 | |
0.1mol／L磷酸缓冲液(m1) | 0.10 | 0.]0 | 0.10 | 0.10 | 0.10 |
2mmol／L丙酮酸标准液(m1) | 0 | 0.05 | 0.10 | 0.15 | 0.20 |
底物缓冲液(m1) | 0.52 | 0.45 | 0.40 | 0.35 | 0.30 |
相当于酶活力(卡氏单位) | 0 | 28 | 57 | 97 | 150 |
与对应的卡门氏酶活力单位作图。
4、参考值：5～25卡门氏单位
5、附注
卡门氏单位的定义系lml血清在卡门氏测定法规定的条件下，在温度32℃，每分钟能使反应液在340nm波长下吸光值降低0．00lA为一个卡门氏单位。
（二）赖氏比色法测定AST
血清中AST作用于由门冬氨酸和α-酮戊二酸组成的底物，在一定的反应条件下，生成一定量的草酰乙酸，草酰乙酸在反应过程中又自行脱羟生成丙酮酸。在酶反应到达规定时间时，加入2．4-二硝基苯肼，在酸性条件下，终止酶反应，其后的反应原理同ALT测定。
1、试剂
（1）0．1mol／L磷酸盐缓冲液pH7．4
（2） lmmol／L 2．4二硝基苯肼溶液
（3） 0．4mol／L氢氧化钠溶液
（4） 2mmol／L丙酮酸标准液
以上四种试剂与ALT比色测定法相同。
（5）
AST底物溶液(DL-门冬氨酸200mmol／L，α-酮戊二酸2mmol／L)：称取α-酮戊二酸24．2mg和DL-门冬氨酸2．66g，置于一小烧杯内，加入1mol／L氢氧化钠约1．5ml溶解，加0．1mol／L磷酸缓冲液约50ml，调节pH7．4，将溶液移入100ml容量瓶中，用磷酸盐缓冲液稀释至刻度，置冰箱保存。
2、操作
同ALT比色测定法，但酶反应作用时间改为60分钟。
标准曲线绘制，按表3顺序加液，制备AST测定标准管
表3 赖氏法测定AST标准曲线的操作步骤
加入物（ml） | 管 号 | ||||
4 | 0 | 1 | 2 | 3 | |
0．1mol/L磷酸盐缓冲液 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 |
底物溶液 | 0.52 | 0.45 | 0.40 | 0.35 | 0.30 |
2mmol/L丙酮酸标准液 | 0 | 0.45 | 0.40 | 0.35 | 0.30 |
相当于酶活力（卡门单位） | 0 | 24 | 61 | 114 | 190 |
其余步骤同ALT标准曲线的绘制 |
3、参考值: 8～28卡门氏单位
4、附注
（1）绘制好标推曲线是赖氏法的基础。赖氏法测定转氨酶的标准曲线是一条典型的曲线。能否作好这条曲线反映了检验人质的基本操作水平，因此必须反复练习。绘制标准曲线时的操作与反应条件应和实际测定时一致。更换试剂和温度变化时应重新绘制标准曲线。
（2）测定用的底物配制成应用液后，可根据用量，用试管或小瓶分装冰冻保存。测定时取出所需用量，用后将多余的弃去，以保证质量。切忌反复冻融使用。
（3）2．4-二硝基苯肼很易从试剂中析出，每天使用前应仔细观察，一旦发现沉淀，应立即弃去不用。
（4）每批0．4mol／L氢氧化钠掖应用草酸标准液标定，防止由于浓度差异引起显色读数不稳。
（5）每次测定时最好做三管试剂空白、一管28单位标准、一管57单位标准。如果试剂空白管对水的光吸收读数在绘制标准曲线时的空白管均值土0．015A范围内，说明试剂没有问题。两管标准管光吸收值减去空白管光吸收均值后的读数在绘制曲线读数土0．005A范围内，说明操作符合要求。最好能同时测定转氨酶控制物。
（6）丙酮酸和苯肼形成苯腙的反应温度，以及加碱后的显色温度和加液方法，都会影响显色反应。因此在进行一批标本测定时，底物及苯肼试剂应置于37℃水浴箱预温，反应时间及加液方法力求一致，保温后置冷水浴中，待冷却后再比色。
（7）严重脂血、黄疸或溶血血清可能会引起测定管吸光值增高，检测此类标本，必须作血清标本对照管。
（8）酶活力超过150卡门氏单位时，应将血清用生理盐水稀释5～10倍后再行测定。
