三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(20)
二、血清高密度脂蛋白胆固醇测定
HDL是血清中颗粒数最多的脂蛋白，一般可分为HDL2及HDL3两部分。流行病学及临床研究证明，HDL-C减少(主要是HDL2—C减少)是冠心病的危险因素后，测定HDL-C的需求不断增加。因为HDL中含蛋白质与脂质各半，脂质中主要为磷脂与胆固醇，通常以测定胆固醇含量(HDL-C)代表HDL水平。我国人HDL-C占血清TC的28％一30％。测定的第一步是将HDL与其他脂蛋白分离。现在临床检验中大都用大分子多阴离子化合物与两价阳离子沉淀LDL与VLDL，然后用酶法测定上清液中的胆固醇。早期用肝素—Mn2+为沉淀剂，有时VLDL沉淀不完全。后来美国脂质研究中心(Lipds ResearchCenter，LRC)推荐硫酸葡聚糖(DS)—Mn2+法，所用DS分子量50000，法国Sochibo产品，昂贵而不易购得。现今国内外试剂盒大都用磷钨酸(PTA)—Mn2+沉淀，试剂价廉易得，使用方便，结果与肝素—Mn2+法和DS—Mn2+法基本一致。以下介 绍此法。
(一)原理
血清中含apoB的脂蛋白[包括LDL、VLDL与Lp(a)]经PTA—Mn2+沉淀后，上清液HDL，其胆固醇含量用酶法测定(同TC测定)。
(二)试剂??
1．沉淀剂
称取PTA 0．440g与MgCl2·6H20 1.10g(均用分析试剂)，溶于80ml蒸馏水中，以lmol／LNaOH液校pH至6.15(约用1.3m1)，然后以蒸馏水定容至100ml，此试剂至少稳定一年。
2．酶试剂? 同TC测定。
3．参考标准? 低胆固醇的定值血清。或将TC测定用定值血清适当稀释(1:2或1:3)后用。
(三)测定操作
用早晨空腹(12小时)血，当天上午测定。如需冰冻保存，只能冻一次，化冻后即测定。
于小离管中加血清200μ1，沉淀剂200μ1，充分混合，室温放置10分钟后离心(3000转／分钟，15分钟)，吸取上清液测胆固醇，按表1操作。
表1? 血清高密度脂蛋白胆固醇酶法测定的操作
| 空白管 | 标准管 | 标本管 | |
|---|---|---|---|
| 上清液(u1)? | - | - | 50 |
| 定值血清(u1) | - | 25 | - |
| 蒸馏水(u1) | 50 | 25 | - |
| 酶试剂(m1) | 2.00 | 2.00 | 2.00 |
混匀，敢置37℃、5分钟(时间可随试剂盒而定)后，用光度计500nm测吸光度(A)
计算： 标本管A
HDL-C(mmol／L)＝--------------X定值血清胆固醇(mmol／L)
标本管B
(四)参考值
成年男性1.16—1.42mmol／L(45—55mg／d1)，女性1.29—1.55mmol／L(50—60mg／d)，随年龄的变动很小。通常以0.9mmol／L(35mg／皿)以下为明显偏低。
(五)附注：
1．血清在室温下放置时，各类脂蛋白之间还会进行脂质交换，游离胆固醇不断酯化，故须及时测定，否则应低温保存。
2．沉淀后的上清液必须澄清，在血清严重浑浊时LDL与VLDL不易沉淀完全，此时可用生理盐水将血清作1：1稀释后再行沉淀，测得结果乘以2。
3．血清加沉淀剂后必须在4小时内完成胆固醇测定
4．美国CDC制备的HDL-C参考血清需要与标本同时进行沉淀及胆固醇测定两个步骤，在一60℃保存可稳定6个月，每小管化冻后只供一次使用。CDC对HDL-C测定的准确性有较高要求，血清HDL—C水平<40mg／d1、40—59．9mg／dl及>60mg／d1时，重复测定的最大可允许偏差分别定为2.5，3.0及3.5mg／d1。国内HDL-C测定方法不统一，尚无合适的参考物及质控血清供应，各地报道的参考值差异较大。
三、血清低密度脂蛋白胆固醇测定
前面已述及LDL-C的Friedewald公式计算法，现在简单介绍直接测定法，即选择性沉淀LDL的方法，这类方法有几种，例如有的试剂盒应用肝素—枸椽酸钠沉淀法，其缺点是要严格控制反应pH。所以现在用聚乙烯硫酸(PVS)沉淀法者较多，如Boehringer试剂盒为美国LRC所选用。
(一)原理
用PVS选择性沉淀血清中的LDL，测出上清液中的胆固醇代表HDL－C与VLDL-C之和，所以TC减去上清液胆固醇即得LDL-C值。试剂中含EDTA用以去除两价阳离子，避免VLDL共同沉淀。适量的中性多聚物(聚乙二醇独甲醚，PEGME)用以加速沉淀。胆固醇测定同TC测定。
(二)试剂?
1．沉淀剂
每l00ml中含PVS钾盐30mg，EDTA·Na2—2H20186mg及PEGME 16ml。可在4℃冰箱存放，至少稳定3个月。(PEGME为粘稠性液体，要确保加量准确。)
2．酶试剂 同TC测定。
3．参考标准 同TC测定用定值血清。
(三)操作步骤
用早晨空腹血清。如在4℃存放不得超过4天，深低温保存只能冻一次，化冻后即须测定。於小离心管中加入血清200μl，沉淀剂100μl，混合，室温放置15分钟，离心(3000转／分钟，15分钟)，取上清液按表2操作．
表2? 血清低密度脂蛋酶法测定的操作手续
| 空白管 | 标准管 | 标本管 | |
|---|---|---|---|
| 上清液(u1)? | - | - | 30 |
| 定值血清(u1) | - | 20 | - |
| 蒸馏水(u1) | 30 | 10 | - |
| 酶试剂(m1) | 2.00 | 2.00 | 2.00 |
混合后，放置37℃，5分钟，用光度计测吸光度(A)，波长500nm。
计算： 标本管A
上清液胆固醇 (mmol／L)＝---------------X定值血清胆固醇(mmol／L)
标本管B
LDL-C(mmol／L)＝TC一上清液胆固醇(mmol／L)
(四)参考值
LDL-C水平随年龄上升，中、老年人平均约2.7—3.lmmol／L(105—120mg／dL)。一般以3．36mmol／L(130mg／d1)以下为合适水平：4.14mmol(160mg／d1)以上为危险水平；3.36—4.14mmol之间为危险边缘或程度危险(危险是指动脉粥样硬化发生的潜在危险性)。
(五)、附注
1．本法沉淀物中也包括Lp(a)，因Lp(a)胆固醇较低，通常对LDL-C测出结果不作校正。
2．VLDL很高时影响LDL沉淀。血清甘油三酯在4.5mmol／L(400mg／d1)以下时，与超离心结合沉淀法(美国LRC法)结果一致。甘油三酯4.5mmol／L以上时，多数标本测定结果仍与LRC法一致，部分标本会因LDL沉淀不完全而使结果偏低。故在血清严重混浊时，可将血清稀释一倍后测定。
3．干扰因素除高VLDL外，显色反应的干扰物同TC测定。
4．血清与沉淀剂混合后，放置时间不得超过一小时。
5．本法精密度好，批内与批间CV<2％。
