药物检测案例--喹诺酮类药物及其制剂的质量检测
一、性状
吡哌酸、诺氟沙星、盐酸环丙沙星和氧氟沙星的性状描述见表1。
二、鉴别
(一)化学法
1.丙二酸反应 此反应对叔胺基团有选择性。本类药物分子中含有叔胺基团,与丙二酸在醋酐中共热时,呈现棕色、红色紫色或蓝色。药典采用该法鉴别诺氟沙星软膏、乳膏。
诺氟沙星软膏的鉴别方法:取含量测定项下的供试品溶液5ml,置水浴上蒸干,残渣中加丙二酸约50mg与醋酐1ml,在水浴中加热10分钟,溶液显红棕色。
2.氯化物鉴别反应 本类药物的盐酸盐,可利用氯化物鉴别反应进行鉴别,如盐酸环丙沙星采用该法鉴别。
(二)光谱法
1.紫外-可见分光光度法 本类药物结构中具有苯环或芳杂环共轭结构,在紫外光区有特征吸收,可用于定性鉴别。药典采用此法鉴别吡哌酸(原料、片剂、胶囊剂)氧氟沙星(片、胶囊、眼膏、滴眼液、滴耳液)诺氟沙星(乳膏、滴眼液)等。例如,氧氟沙星胶囊的鉴别方法为:取本品内容物适量,用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含氧氟沙星6μg的溶液,滤过,取续滤液,照紫外-可见分光光度法测定,在294nm的波长处有最大吸收。
2.红外分光光度法药典对收载的喹诺酮类原料药几乎均采用了本法进行鉴别。如司帕沙星的鉴别:本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。
(三)色谱法
1.薄层色谱法药典采用薄层色谱法鉴别诺氟沙星、氧氟沙星、盐酸环丙沙星(原料、片、胶囊)等。
例如,诺氟沙星的鉴别方法为:取本品与诺氟沙星对照品适量分别加三氯甲烷一甲醇(1:1)制成每1ml中含2.5mg的溶液,作为供试品溶液与对照品溶液。照薄层色法试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷醇-浓氨溶液(15:10:3)为展开剂,展开,晾干置紫外线灯(365nm)下检视。供试品溶液所显主斑点的位置与荧光应与对照品溶液主斑点的位置与荧光相同。
2.高效液相色谱法药典收载的喹诺酮类药物的原料药及其绝大多数制剂采用的记录的色谱图中,HPLC法鉴别。例如,盐酸环丙沙星的鉴别方法:在含量测定项下的记录的色谱图中,供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
三、检查
喹诺酮类药物的检查项目有溶液的澄清度、有关物质、颜色、吸光度、干燥失重灼残渣、重金属、细菌内毒素等。此处重点介绍溶液的澄清度、干燥失重、有关物质及溶出度测定法。
(一)一般杂质检查
1.溶液的澄清度本类药物在碱溶液中易溶,采用氢氧化钠试液为溶剂,检查碱中不溶性杂质,主要为哌嗪等碱性化合物及中间体等。例如,药典规定诺氟沙星溶液的澄清度检查方法为:取本品5份,各0.5g,分别加氢氧化钠试液10ml溶解后,溶液应澄清;如显浑浊,与2号浊度标准液比较,均不得更浓注意:进行本项检查时要迅速观察因为时间稍长,有些碱中不溶性杂质可分解而溶解。
若被测药物为盐,一般以水为溶剂,检查水中不溶性杂质。例如,盐酸环丙沙星“溶液的澄清度与颜色”检查方法为:取本品0.1g,加水10ml溶解后,溶液应澄清;如显色,与黄色或黄绿色4号标准比色液比较,不得更深。
2.干燥失重 喹诺酮类药物在潮湿空气中易吸收水分,故本类药物一般规定检查干燥失重。例如,吡哌酸检查干燥失重的规定限度为150%～16.0%,若小于15.0%,说明其中混有无水物。吡哌酸含3分子结晶水,理论含水量为15.12%。药动学试验表明,口服给药后三水合物的血药浓度比无水物高。尿中排泄也明显优于无水物。三水合物较无水物在水中和消化道中的溶解速度快,生物利用度高对铜绿假单胞菌感染的疗效也比无水物高,但两者在毒性上并无差别。可见吡哌酸的干燥失重检查是控制质量的重要项目。
(二)特殊杂质检查
喹诺酮类药物在生产和贮藏中可能引入原料、中间体、副产物、异构体、分解产物等有关物质,影响药物疗效和产生毒副反应,应进行严格控制。药典主要采用HPLC法检查喹诺酮类药物的有关物质,如诺氟沙星氧氟沙星、左氧氟沙星及盐酸环丙沙星等有关物质的检查,采用C18柱,流动相梯度洗脱,紫外检测的方法。
(三)制剂检查
本类药物在水中极微溶解,体内吸收受到其溶解速度的影响,因而需要测定其口服固体制剂的溶出度。药典采用紫外分光光度法测定吡哌酸,盐酸环丙沙星,氧氟沙星的片、胶囊及诺氟沙星胶囊的溶出度。
诺氟沙星胶囊溶出度的测定方法:取本品照溶出度测定法(第二法)以醋酸缓冲液(取冰醋酸2.86ml与50%氢氧化钠溶液ml,加水900ml,振摇,用冰醋酸或50%氢氧化钠溶液调节pH至4.0,加水至100ml)1000ml为溶出介质,转速为每分钟50转,依法操作,经30分钟时,取溶液适量,滤过,精密量取续滤液适量,用溶出介质定量稀释制成每1ml约含5μg的溶液,作为供试品溶液,照紫外-可见分光光度法,在277nm的波长处测定吸光度;另取诺氟沙星对照品适量,密称定,加溶出介质溶解并定量稀释制成每1ml中含5μg的溶液,同法测定,计算每粒的溶出量。限度为标示量75%,应符合规定。
四、含量测定
药典主要采用高效液相色谱法测定喹诺酮类药物的含量,少数几个品种的含量测定采用非水滴定法和紫外-可见分光光度法。
(一)非水溶液滴定法
本类药物分子结构中具有哌嗪基团,碱性,可用酸性非水溶剂溶解样品,以增加其碱性,以适当的指示剂或电位法指示终点,高氯酸为滴定液进行滴定。药典采用该法测定吡哌酸的含量。
吡哌酸的含量测定方法:取本品约0.2g,精密称定,加冰醋酸20ml溶解后,加结晶紫指示液1滴,用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液显纯蓝色,并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于30.33mg的C14H17FN5O3。
(二)紫外可见分光光度法
本类药物分子结构中具有苯环或杂环共轭结构,在紫外光区有特征吸收,可用于定量。本法用于制剂的测定时,注意消除辅料的干扰。药典采用该法测定吡哌酸片剂、胶囊及诺氟沙星乳膏的含量。
吡哌酸片的测定方法:取本品10片,精密称定,研细,精密称取适量(约相当于C14H17N5O3·3H2O 0.2g),置500ml量瓶中,0.01%盐酸溶液适量,超声使吡哌酸溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,精密量取续滤液2m,置250ml量瓶中,加0.01%盐酸液稀释至刻度,摇匀,照紫外可见分光光度法在275nm的波长处测定吸光度;精密称取吡哌酸对照品适量,加0.01%盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含C14H17N5O3·3H2O 3μg的溶液,同法测定。计算出供试品中C14H17N5O3·3H2O的含量。
(三)高效液相色谱法
喹诺酮类药物含有酸性羧基和碱性哌嗪基,能在水中解离,多用离子抑制色谱法进行含量测定。通过向流动相中加入少量弱酸、弱碱或缓冲盐为抑制剂,调节流动相的pH或利用同离子效应,抑制相应的弱酸、弱碱解离使被测组分保持分子状态,以增加它们在反相固定相中的溶解度,延长保留时间,以达到分离有机弱酸、弱碱的目的。采用离子抑制色谱法测定时,流动相的pH需为2～7.5。试验完成后,应及时用不含酸、碱及缓冲盐的流动相冲洗管路,以防腐蚀仪器流路系统。药典采用离子抑制色谱法测定盐酸环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星及其制剂等药物的含量。
