药物检测案例介绍--头孢菌素类药物及其制剂的质量检测
一、性状
头孢氨苄、头孢克洛及头孢呋辛钠的性状描述见表1。
二、鉴别
(一)化学法
1.羟肟酸铁反应头孢菌素在碱性条件下与羟胺作用,β-内酰胺环破裂生成羟肟酸;在稀酸中与高铁离子反应呈色。《中国药典》二部采用羟肟酸铁反应鉴别头孢哌酮,方法为:取本品约10mg,加水2ml与盐酸羟胺溶液 取34.8%盐酸羟胺溶液1份,醋酸钠-氢氧化钠溶液(取醋酸钠10.3g与氢氧化钠86.5g,加水溶解使成1000ml)1份,乙醇4份,混匀3ml,振摇溶解后,放置5分钟,加酸性硫酸铁铵试液1ml,摇匀,显红棕色。
2.钾盐或钠盐的鉴别反应 头孢菌素类药物中,许多制成钾盐或钠盐,因而显钾
盐或钠盐的鉴别反应。
(二)光谱法
红外吸收光谱法反映了分子的结构特征,该法具有专属性高的特点,各国药典对收载的头孢菌素类抗生素均采用了本法鉴别。
(三)色谱法
高效液相色谱法和薄层色谱法被广泛应用于本类药物的鉴别。利用比较供试品与对照品主峰的保留时间(tR)或斑点的比移值(Rf)是否一致进行鉴别。《中国药典》二部收载的头孢菌素类抗生素大多采用高效液相色谱法进行鉴别。如头孢呋辛钠规定在含量测定项下记录的色谱图中,供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
药典采用薄层色谱法鉴别头孢克洛。方法为:取本品适量,加水溶解并制成每1ml中约含2mg的溶液,滤过,取续滤液作为供试品溶液;另取头孢克洛对照品适量,加水制成每1ml中约含2mg的溶液,作为对照品溶液;再取对照品和供试品适量,加水制成每1ml中各含2mg的溶液,作为混合溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各2μl,分别点于同一硅胶H薄层板[取硅胶H2.5g,加0.1%羧甲基纤维素钠溶液8ml,研磨均匀后铺板(10cm×20cm),经105℃活化1小时,放入干燥器中备用],以新鲜配制的0.1mol/L枸橼酸溶液-0.1mol/L.磷酸氢二钠溶液-6.6%茚三酮的丙酮溶液(60:40:1.5)为展开剂,展开,晾干,于110℃加热15分钟后检视。供试品溶液所显主斑点的颜色和位置应与对照品溶液的主斑点相同,混合溶液应显一个斑点。
三、检查
头孢菌素类抗生素生产工艺复杂,生产过程不易控制,异物污染可能性较大,因此化学纯度较低。本类药物结构、组成复杂,同系物多,异构体多。此外,β-内酰胺环稳定性差,容易导致产品发生降解。故本类药物中易引入较多杂质,检查项目主要有高分子聚合物、有关物质、异构体、细菌内毒素、热原、无菌、溶出度、结晶性、溶液的澄清度与颜色、水分、酸度或酸碱度、炽灼残渣、重金属等,个别药物还检查沉降体积比、吸光度等。本品的含水量与pH对稳定性影响较大,故本品一般需控制水分、酸度或酸碱度。水分的测定数据直接影响本品的含量测定结果,一般采用费休法测定水分。
(一)特殊杂质检查
1.高分子聚合物的检查抗生素类药物中的高分子杂质是指分子量大于药物本
身的杂质总称,其分子量一般在1000～5000,个别可至10000Da左右。高分子杂质主要分为蛋白(多肽)类杂质和聚合物杂质两类,前者主要来自生产过程的残留或污染,后者主要是抗生素在生产、贮存和使用条件下发生的分子间的聚合反应产物。抗生素所致的速发型过敏反应和其中的高分子杂质有关,因此检查高分子聚合物是控制产品内在质量的重要环节。药典采用分子排阻色谱法测定某些β-内酰胺类抗生素品种中高分子杂质的含量。
在特定条件下,β-内酰胺类抗生素可以缔合成与高分子杂质有相似色谱行为的
缔合物,即在Kav(有效分配系数)=0处表现为单一的色谱峰。以药物自身为对照品,测定其在特定条件下缔合时的峰响应指标;再改变色谱条件,测定供试品中高分子杂质和药物分离后Kav=0处高分子杂质的峰响应指标;按外标法计算,即得药品中的高分子杂质相当于药品本身的相对含量。
例如,《中国药典》二部规定头孢呋辛钠应检查头孢呋辛聚合物。检查方法如下。
色谱条件与系统适用性试验 用葡聚糖凝胶G-10(40～120μm)为填充剂;玻璃内径1.0-1.4cm,主高度30-40cm;pH7.0的0.025mol/L磷酸盐缓冲液为流动相A,以水为流动相B,流速约为每分钟1.5ml,测波长为254nm。
对照品溶液的制备 取头孢呋辛对照品约20mg,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含40μg的溶液。
测定法 取本品约0.2g,精密称定,置10ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,立即精密量取100～200μl注入液相色谱仪,以流动相A为流动相进行测定,记录色谱图。另精密量取对照品溶液100～200μl注入液相色谱仪,以流动相B为流动相,同测定。按外标法以峰面积计算,含头孢呋辛聚合物以头孢呋辛计,不得过0.2%。
2.有关物质和异构体的检查本类药物多采用半合成方法制备,在生产中容易引入原料、中间体、副产物等杂质,统称为有关物质,并可能生成异构体。由于本类药物广泛应用HPLC法测定含量,因此,有关物质和异构体检查也同时采用HPLC法。头孢氨苄是以青霉素钾为原料,经氧化、扩环、裂解得7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸,再与侧链α-苯甘氨酸缩合而成。因此成品中可能引入7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸、α-苯甘氨酸和其他杂质。《中国药典》二部采用HPLC法检查头孢氨苄中有关物质。方法为:精密称取本品适量,加流动相A溶解并稀释制成每1ml中约含1.0mg的溶液,作为供试品溶液;精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液;取7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸对照品和α-苯甘氨酸对照品各约10mg精密称定,置同一100ml量瓶中,加pH7.0磷酸盐缓冲液约20ml,超声使溶解,再用流动相A稀释至刻度,摇匀。精密量取2.0ml,置20ml量瓶中,用流动相A稀释至刻度,摇匀,作为杂质对照品溶液。
头孢呋辛酯中容易引入异构体,药典规定头孢呋辛酯及其片剂、胶囊应检查异构体。头孢呋辛酯中异构体的检查方法为:取本品适量,照含量测定项下的方法试验,供试品溶液色谱图中头孢呋辛酯A异构体峰面积与头孢呋辛酯A、B异构体峰面积和之比应为0.48～0.55。
(二)安全性检查
主要检查细菌内毒素和无菌,个别头孢类药物检查热原、异常毒性。
1.细菌内毒素 细菌内毒素是革兰阴性细菌细胞壁外层中的脂多糖和蛋白的复合物。细菌内毒素是对人和实验动物致热性最强的一种生物活性物质,故细菌内毒素检查是抗生素质量控制中的一项重要指标,关系用药安全和患者的生命安危。
《中国药典》二部利用试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。药典二部规定头孢呋辛钠应检查细菌内毒素,方法为:取本品,依法检查,每1mg头孢呋辛中含内毒素的量应小于0.10EU。
2.无菌 无菌检查法是指检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。用微生物发酵工艺提取的抗生素容易引入细菌,为保证用药安全,药典二部规定头孢呋辛钠应检查无菌,方法为:取本品,用适宜溶剂溶解后转移至不少于500ml的0.9%无菌氯化钠溶液中,用薄膜理后,依法检查,应符合规定。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明供试品在该检查条件下未发生微生物污染。
3.热原 热原是指药物中含有的能引起体温升高的杂质,主要来源于革兰阴性细
菌。用微生物发酵工艺提取的抗生素尤其容易污染热原。含有热原的注射剂,静脉注入人体15分钟左右,就能引起发冷、寒战、热,严重时出现恶心、呕吐等,甚至昏迷、休克死亡。药典二部采用家兔作为实验动物模型,将一定剂量的供试品静脉注入家兔体内,在规定的时间内,观察家兔体温升高的情况,以判断供试品中所含热原的限度是否符合规定。在头孢类药物中,基本由细菌内毒素检查取代热原检查。
4.异常毒性 异常毒性检查法是指给予小鼠一定剂量的供试品溶液,在规定时间
内观察小鼠出现的死亡情况,以判定供试品是否符合规定的一种方法。如,药典规定头孢地嗪钠应检查异常毒性,方法为:取本品,加氯化钠注射液制成每1ml中含0.1g的溶液,依法检查,按静脉注射法给药,应符合规定。
四、含量测定
《中国药典》二部中收载的本类药物及其制剂共70种之多,均采用高效液相色谱法测定含量。高效液相色谱法能有效分离供试品中可能存在的降解产物、残留的原料及中间体等杂质,并能准确定量。药典采用该方法测定头孢氨苄及其胶囊的含量、头孢克洛及其制剂的含量,头孢呋辛酯及其制剂的含量。
1.外标法测定头孢氨苄的含量
2.外标法测定头孢氨苄胶囊的含量取装量差异项下的内容物,混合均匀,精密称取适量(约相当于头孢氨苄0.1g),置100ml量瓶中,加流动相适量,充分振摇,使头他氨苄溶解,再加流动相稀释至刻度,摇匀,滤过,精密量取续滤液10ml,置50ml量瓶中用流动相稀释至刻度,摇匀,照头孢氨苄项下的方法测定,即得。头孢氨苄胶囊相当于标示量的百分含量按式计算:
式中,AR为对照品的峰面积;Ax为供试品的峰面积;Vs为供试品溶液的定容体积;VR为对照品溶液的定容体积;DS为供试品溶液的稀释倍数;DR为对照品溶液的稀释倍数;mR为对照品的称样量;ms为供试品的取样量;
为平均装量。
