分子生物学常用实验技术（十六）
（三）电泳：
1、预电泳
（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。
（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE 缓冲液。
（3）稀释10×TBE 缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。
（4）有些电泳槽，如LKB 的Macrophor 等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。
（5）按30V/cm 的电压预电泳20-30 分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC 丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。
[注意]
（1）. 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm 左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。
（2）. 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。
2、样品的制备：
当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3
分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4-6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4mm。厚度小于0.4mm
的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。
3、上样及电泳
关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm
进行电泳，5 分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm 长，0.2mm 厚的凝胶板，在2500V
恒压状态下电泳2 小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA 降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。
[注意]
1、上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。
2、一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。
（四）、测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20 分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3 次，每次2 分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20 秒，使水流尽。
4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30 分钟。
5. 凝胶显影：
(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。
(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10 秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10 秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
(3). 立刻将凝胶转移至1 升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1 升显影液中继续显影2--3 分钟,或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2 分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF 胶片保留实验结果。
[注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。
1. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。
2. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher 和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500 或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。
3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。
4. 如果凝胶厚度超过0.4mm 或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4mm 薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5 秒。
5. 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。
（五）、EDF 胶片显影
使用EDF 胶片可增强测序条带的对比度，如果测序胶上条带很淡，我们建议把数据转移至EDF胶片，银染胶在其影像转移至EDF 胶片之后可增强条带可读性。
1. 在暗室内，将染色过的粘于玻璃板的凝胶(胶面向上)置于荧光灯箱上。如有合适的漫射板，亦可用白灯箱，为确保曝光时间, 用一小条EDF 胶片曝光不同时间, 检查不同的曝光强度, 一般曝光20--40 秒可得较好结果。
2. 在红灯下找到EDF 胶片有缺刻的一角, 然后把胶片置于凝胶上，使缺口位于左上角。由于EDF胶片是单面的，因此必须确保缺口在左上角。
3. 在EDF 胶片上放置一干净、干燥的玻璃板，开亮灯箱约20 秒。
4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影EDF 胶片，可使用下列操作过程:
a. 在Kodak GBX 显影液中显影1-5 分钟;
b. 水洗1 分钟;
c. 在Kodak GBX 定影液中定影3 分钟;
d. 水洗1 分钟.
[注意] 1. 进行EDF 胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作, 以免印上指纹。同时注意EDF 胶片不能用自动胶片处理器。
2. 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同，通过对一小条EDF 胶片曝光不同时间以选择你所用光源的最佳曝光时间，参阅胶片说明书。
3. 曝光时间短则EDF 胶片影像较深，曝光时间长则有助于减弱背景。
