分子生物学常用实验技术（十七）
第二节T7 DN A 聚合酶测序技术
一、概述
T7 DNA
聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及单链和双链3'→5'外切酶活性。当T7 DNA
聚合酶用适当方法处理后，可使3'→5'外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA 聚合酶又称T7 测序酶。使用T7
测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此, 放射自显影所得到的结果较为清晰易辩, 对于许多模板来说, 使用含有dGTP
的混合物即可得到理想的测序结果。然而, 如果出现了带压缩的问题，则用含dITP 的混合物来取代常规的dGTP。dITP 的掺入，使在富含GC
的模板中也能有效地消除带压缩现象。
T7 测序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延续性，正因如此，该酶在使用中不同于Klenow
片段和反转录酶。它几乎没有错误性的终止，整个反应在很短的时间内完成，并且不需要进行追加反应(Chase
step)。然而对于有紧密二级结构的区域, 错误的终止反应会给阅读序列带来困难。如果碰到这些情况，应使用一些高温DNA 聚合酶，如Promega
公司的测序级Taq DNA 酶。利用高温DNA 聚合酶独有的耐热特性，测序反应可在不利于形成二级结构的高温条件下进行。T7 DNA
聚合酶测序的快速而简便的方法是从Klenow 酶和AMV 反转录酶测序的操作步骤修改而来的，它的最大优点是具有很高的5'-3'的DNA
合成活性和极低的3'-5'端外切酶的活性。在测序过程中，若以同位素标记则相对于大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的大片段Klenow，或反转录酶AMV
而言，则可使条带非常的均一，并且它的放射性背景极低。T7 DNA 聚合酶测序时DNA
的合成的过程是分二步完成的。第一步为标记反应阶段，第二步方为双脱氧链末端终止的DNA
合成过程。在第一步过程，引物的延伸是在较低浓度的脱氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反应过程中，已含有经放射性标记的dATP。第二步过程中，脱氧三磷酸核苷酸浓度提高，并且加入双脱氧的三磷酸核苷酸，DNA
在合成过程中，因加入的双脱氧三磷酸核苷酸而随机终止，形成长短不一的DNA 片段。
二、材料待测的DNA 模板，可用双链或单链模板。
三、设备高压电泳仪，测序用电泳槽，照相显影用大号塑料盆，制胶设备，吹风机，放射自显影盒，X-光片。
四、试剂
1、5×T7 DNA 聚合酶缓冲液：200mmol/L Tris?Cl, pH7.5, 100mmol/L MgCl2, 250mmol/L NaCl。
2、引物：使用通用引物pUC/M13 正向或逆向引物。
3、DTT ： 0.1mol/L。
4、5×常规标记混合物：7.5mmol/L dGTP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。
5、5×dITP 标记混合物：15mmol/L dITP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。
6、dNTP A 溶液（适用于dGTP): 80mmol/L dGTP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/LdTTP, 50mmol/L NaCL。
7、ddG 终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A 溶液再加8mmol/L ddGTP。
8、ddA 终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A 溶液再加8mmol/L ddATP。
9、ddT 终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A 溶液再加8mmol/L ddTTP。
10、ddC 终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A 溶液再加8mmol/L ddCTP。
11、dNTP B 溶液（适用于dITP): 160mmol/L dITP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/LdTTP, 50mmol/L NaCl。
12、ddG 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B 溶液再加1.6mmol/L ddGTP。
13、ddA 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B 溶液再加1.6mmol/L ddATP。
14、ddT 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B 溶液再加1.6mmol/L ddTTP。
15、dd C 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B 溶液再加1.6mmol/L ddCTP。
16、测序用T7 DNA 测序酶。
17、酶稀释缓冲液：10mmol/L Tris?HCl, pH7.5, 5mmol/L DTT, 0.5mg/ml BSA 。
18、终止溶液： 95%甲酰胺，20mmol/L EDTA, 0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯兰。
19、[a-32P]dATP 或[a-35S]-dATP, 35S 的优点是可使条带为窄而清晰，并且操作更为安全。放射强度为：1000-1500Ci/mmol，10mCi/ml。
20、TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA, pH7.5。
21、上节所述的凝胶制备过程中的全套试剂。
22、X 光显影液：H2O：50℃ 800ml，米吐尔2.2g，无水Na2SO3 72g，对苯二酚8.8g，无水NaCO3 48g , KBr 4g， 定容至1000ml 备用。
23、F-5 坚膜定影液：水600ml , Na2S2O3 240g, Na2SO3 15g, 冰醋酸13.4ml；硼酸7.5g ，粉状钾矾15g ，定容至1000ml 备用。
24、TYP 肉汁培养基：16g 蛋白胨，16g 酵母提取物，5g NaCl, 2.5g K2HPO4，加水溶解，定容至1000ml。
25、20%PEG/3.75mol NH4Ac 溶液：40% PEG（分子量8000）储备液和7.5mol/L pH7.2 NH4Ac储备液等体积混合。
五、操作步骤：
（一）、模板制备
1、M13
单链模板制备：在转化入合适的大肠杆菌宿主菌且在含有指示剂如X-gal/IPTG 的培养基上铺板之后, 含有M13
重组子的细胞将表现出无色的"噬菌斑"，事实上受感染的细胞并非被噬菌体溶菌或杀死，出现噬菌斑是因为被感染的细菌在生长速度上比其周围未感染的细菌慢的缘故,
从无色噬菌斑上得到的感染细胞经培养便能产生测序反应所需的单链模板。
（1）过夜培养的宿主细胞(如NM522 或JM101)用3ml TYP 肉汁培养基以1:100 稀释。在37℃强烈震荡1 小时之后, 细胞进入对数早期。此时, 将一个合适的含有重组M13 的噬菌斑(连同琼脂)用滴管转入该细胞培养液中。
（2）37℃强烈震荡(300rpm) 培养6 小时。
（3）把细胞培养液转入两只1.5ml eppendorf 管, 12000g 离心15 分钟。上清液转移到新的eppendorf 管再离心15 分钟。小心地取出1-1.2ml 上清液(注意不能触及沉淀), 再转到新的eppendorf管。.
（4）将0.25
体积的含20％PEG(-8000)的3.75M 醋酸铵(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌体。混匀后置冰上30 分钟, 再以12000g
离心15 分钟, 倾去上清液, 再以同样方法离心一次, 用吸液器尖头将残留的PEG 充分吸干净。此时应能见管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。
（5）将沉淀物重溶于400ml TE 缓冲液中。
（6）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液, 强烈震荡1 分钟，12000g 离心5 分钟。
（7）将水相转入一新的eppendorf 管, 注意不能触动原管中两相交界面。加等体积苯酚/氯仿(1:1)混合液, 强烈振荡1 分钟, 12000g 离心5 分钟。
（8）将上层水相转入另一新的eppendorf 管, 重复第7 步的提取, 如有必要重复多次直至二相之间无可见物质存在。
（9）将上层水相转入一新的eppendorf 管, 加等体积氯仿, 强烈振荡1 分钟后, 12000g 离心5分钟, 多次重复此步骤。
（10）将上层水相转入新的eppendorf 管, 加0.5 倍体积的7.5 mol/L 醋酸铵, 2 倍体积乙醇, 混匀后-20℃放置30 分钟。
（11）12000g 离心15 分钟, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗沉淀, 如果沉淀已被搅起, 重新离心, 倾去酒精, 真空干燥沉淀物。
（12）将DNA 的沉淀物溶解于20ml 去离子水中，取2ml 样品进行琼脂糖凝胶电泳定量, 如果DNA 量充足, 则可进行退火测序。
2、噬粒(Phagemid)单链模板的制备：
噬粒是指含有丝状单链DNA 噬菌体复制区的嵌合质粒。分子克隆中常用的pBluescript 系列和pGEM系列的质粒均属噬粒。含重组噬粒的细胞单菌落经液体培养并用辅助噬菌体超感染后就能产生测序反应所需的单链DNA 模板。
（1）从新鲜平板上挑得含pGEM 质粒DNA 的抗Amp 单菌落, 并接种到100ml 含有50mg/ml氨苄的TYP 肉汤培养基中, 在37℃振荡过夜。
（2）取100ml 过夜培养物接种到另一新的装有5ml 含50mg/mlAmp 的TYP 肉汁培养基的试管中, 在37℃强烈振荡30 分钟。
（3）加40μl 辅助噬菌体R408 或M13 K07, 继续剧烈搅拌振荡培养6-8 小时，使辅助噬菌体超感染。
（4）12000g 离心15 分钟后，去除沉淀，取上清，转移到一新eppendorf 管中再次离心15分钟.
