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激光共聚焦扫描显微镜基本组成、特点

2019.12.18

一、激光共聚焦显微镜的基本组成

激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。

激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图像等优点。

所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。

激光共聚焦显微镜主要有四部分组成：1、显微镜光学系统。2、扫描装置。3、激光光源。4、检测系统。整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。

1、显微镜光学系统

显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成像的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。

2、扫描装置

LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图像采集速度大大提高，512×512画面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。

3、激光光源

LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器发射波长为633nm的红光，新的405nm半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线，但是小巧便宜而且维护简单。

4、检测系统

LSCM为多通道荧光采集系统，一般有三个荧光通道和一个透射光通道，能升级到四个荧光通道，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。

PMT前设置针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要，也有通过光栅或棱镜分光后进行光谱扫描功能的设置。

二、激光共聚焦显微镜的特点以及在生物领域的应用

传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图像等优点，在对生物样品的观察中，激光共聚焦显微镜有如下优越性：

1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。

2、可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图像、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。

3、多维图像的获得，如7维图像（XYZaλIt）：xyt 、xzt 和xt扫描，时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。

4、细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。

5、荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察；

6、对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。

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