三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(27)
二、己糖激酶法测定血糖
（一）原理
在己糖激酶(HK)催化下，葡萄糖与三磷酸腺苷(ATP)起磷酸化反应，生成6-磷酸葡萄糖(G-6-P)和二磷酸腺苷(ADP)。前者在6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)催化下脱氢，生成6-磷酸葡萄糖酸(6-GP)，同时使辅酶II(NADP或辅酶INAD)还原成还原辅酶II(NADPH或还原辅酶I? NADH)
根据上述反应式，NADPH的生成速率与葡萄糖浓度成正比，在波长340nm监测吸光值上升的速率，计算标本中葡萄糖浓度。
（二）试剂
己糖激酶法测定血糖的试剂在实验室不易配制，用本法测定血糖基本上采用试剂盒。，珥以某试剂盒为例。
组 分
三羟甲基氨基甲烷(Tris) 50mmol／L
三磷酸腺苷(ATP) 1．30mmol／L
辅酶I(NAD) 0．65mmol／L
己糖激酶(HK) 1500Μ／L．
6-磷酸葡萄糖脱氢酶 2500Μ／L
pH7．5±(25℃)
按试剂瓶规定的量加入蒸馏水或去离子水轻轻混匀，溶解试剂瓶内容物。复溶的试剂置2～8~C冰箱保存。
（三）操作
１、仪器：用具有340nm波长，控温37℃，比色杯或流动比色池，光径为１．０cm及可记时的分光光度计测定。
仪器参数
温度 37℃
波长 340nm
吸光范围 0—2A
比色池光径 1．0cm
反应时间 3分钟
试剂体积 1.50ml
标本体积 0.010ml
２、按表3步骤加液
表３ 己糖激酶法测定血糖操作手续
| 加入物（ml） | 测定管 | 空白管 |
酶试剂 | 1.5 | 1.5 |
血清 | 0.01 | — |
蒸馏水 | — | 0.01 |
37℃水浴3分钟，在340nm波长测吸光值以蒸馏水调零 |
3、计算
（１）
式中：A为测定管吸光值一空白管吸光值。
180.2为葡萄糖分子量。
1.51为反应液总体积。
0.01为标本体积。
6．22为NADH1cm340nm的毫摩尔吸光系数。
（２）亦可同时测定己知浓度的葡萄糖标准工作液，按下式计算结果。
（四）附注：
１、根据分光光度计比色池的体积，按比例调整试剂和标本的体积。
２、反应可在30~C进行，但保温时间应延长至6分钟。
３、如分光光度计的流动池光径不是1.0cm，应根据比尔定律校正NADH的吸光系数(如带标准液测定，则不必校正)。
４、空白管吸光度读数应<0.6。如超过0.6，表示试剂污染。
５、标本中葡萄糖浓度超过750ma／dl时，应用生理盐水稀释参示本，测定结果再乘以稀释倍数。
６、如标本严重黄疸，脂血或溶血，则取标本0.01ml加生到：盐水0.5ml，在340nm读吸光值，计算结果前按下式计算A：
Ａ＝测定管吸光值一空白管吸光值一稀释标本吸光值
７、应在加入试剂15分钟内测吸光倬。
８、本法可用自动分析仪进行测定，应按不同分析仪的说明参数进行测定。
三、邻甲苯胺法测定血糖
（一）原理
葡萄糖与邻甲苯胺的强酸溶液加热，分子中的醛基与邻甲苯胺缩合，再经脱水生成蓝色Schiff碱，其吸收峰在630nm。
（二）试剂
１、12mmoL／L苯甲酸溶液? 见葡萄糖氧化酶法。
２、葡萄糖标准贮存液l00mmol／L：见葡萄糖氧化酶法。
３、葡萄糖标准工作液5mmol／L，见葡萄糖氧化酶法。
操作
取数支16×1500mm试管，按表4加液操作
表4 邻甲苯胺法测定血糖
加入物（ml） | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
血浆（或血清、脑脊液 | 0．1 | — | — |
葡萄糖标准工作液 | — | 1．0 | — |
蒸馏水 | — | — | 0．1 |
邻甲苯胺试剂 | 3．0 | 3．0 | 3．0 |
混均，置沸水浴中加热12分钟，取出置冷水中冷却/用分光光度计630nm比色，空白管调零，读标准管及测定管吸光值 |
（四）计算
（五）参考值
空腹血糖3．89～6．11mmol／L(70～110mg /dl)
（六）附注
1、反应液的颜色可稳定约半小时，放置时间过长，颜色可逐渐减退。
2、反应液呈色强度与反应条件有关。不同批号的邻甲苯胺，邻甲苯胺试剂的新旧(如试剂配制后放置过久，呈色变浅)以及加热的温度和加热时间等都会影响呈色。所以要求每批测定时，测定管标准管及空白管的加热温度和时间要完全一致。每批测定管数不宜过多，以便能较好地控制反应条件。
3、甘露糖和半乳糖亦能与邻甲苯胺试剂反应，但这两种糖在血中含量甚微，不影响测定结果。戊糖亦与邻甲苯胺试剂反应，但其生成物的吸收峰不在630nm，不影响测定结果，还可利用两个波长进行葡萄糖和木糖测定。
4、最终反应液偶尔出现混浊，最常见于高脂血症。此时可在反应液中加入异丙醇1.5ml；充分混匀，溶解脂质以消除混浊，测得的吸光值乘以1.5。患者注射右旋糖酐时，由于右旋糖酐不溶于邻甲苯胺试剂而产生混浊，冷却时冷水浴过冷有时变可出现混浊。
5、轻度溶血标本不影响测定结果。明显溶血，血红蛋白超过3.5g／L时，可使测定出现正误差。黄疸标本胆红素超过200mg／L可干扰测定出现正误差。用去蛋白血滤液能避免这些误差。
6、尿毒症患者邻甲苹胺法测定血糖结果偏高。
