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三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(21)

2021.4.26

四、血清甘油三酯测定

　　甘油三酯(TG)测定有化学法与酶法两类。目前国内大医院多已采用酶法。由于酶试剂价格高，不少基层单位仍在应用旧的化学法。经过长时间应用考验，化学法中比较简便可靠的是异丙醇抽提、沸石合剂(或氧化铝)吸附磷脂、乙酰丙酮显色法(即七十年代LRC的统一方法，国内以比色代替测荧光)。此法特点是能较好地去除磷脂与游离甘油的干扰，因此仍可采用。酶法始于七十年代初，经过不断改进，现在的趋势是用单一试剂的甘袖磷酸氧化酶(GPO)法，指示反应同TC测定，也用PAP试剂。此法具有酶法的简速、微量、精密度高的优点，而且反应特异，易于达到终点，线性范围宽，试剂较稳定等多种优点。现在国内外试剂盒大都采用此法，故以下介绍GPO-PAP法。

(一)原理

　　用高效的微生物脂蛋白脂肪酶(LPL)使血清中TG水解成甘油与脂肪酸(胰脂肪酯只能水解成甘油一酯)，将生成的甘油用甘油激酶(GK)及三磷酸腺苷(ATP)磷酸化，以GPO氧化3一磷酸甘油(G—3—P)，然后以PAP试剂显色测定所生成的H202。反应式如下：

　　　　　　LPL　　
　　TG+3H₂0-------→甘油+3RCOOH

　　　　　　　　GK+Mg²⁺
　　甘油4-ATP-----------→G-3-P+ADP

　　　　　　　　GPO
　　G-3-P+0₂--------→磷酸二羟丙酮+H₂0₂：

　　　　　　　　　　　　　POD
　　H₂0+4AAP＋4-氯酚兰--------→苯醌亚胺非那腙+2H₂0＋HCl

(二)试剂

1．酶试剂　组成因不同试剂盒而有差异，举例如下：

　　三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液，pH7.6　　 150mmol／L
　　LPL(假单胞菌屎)　　　　　　　　　　　　　3000u／L
　　GK(念珠菌屎)　　　　　　　　　　　　　　　250u／L
　　ATP　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0．5mmol／L
　　GPO(足球菌屎)　　　　　　　　　　　　　　3000u／L
　　POD(辣根)　　　　　　　　　　　　　　　　10000u／l
　　胆酸钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　3．5mmol／L
　　MgS04—7H20　　　　　　　　　　　　　　　17．5mmol／L
　　4—AAP　　　　　　　　　　　　　　　　　　lmmol／L
　　4一氯酚　　　　　　　　　　　　　　　　　3．5mmol／L
　　TritonX—100　　　　　　　　　　　　　　0．1g／L

2．标准液

　　甘油(纯品)水溶液2．26mmol／L(20．8mg／dL相当于TG200mg／d1)。本法中LPL对TG水解完全，用甘油或三油酸酯为标准结果一致。

(三)测定步骤

　　取血前两天内不要进食大量脂肪的食品，早晨空腹(12小时)取血。

　　测定管，标准管与空白管分别加血清标准液及蒸馏水各10ul，酶试剂各1.00ml，37℃10分钟后用光度计测吸光度（A)，波长500nm，颜色至少可稳定1小时。

计算：
　　　　　　　　　　　　测空管A
　　血清TG(mmol／L)＝--------------×2.26
　　　　　　　　　　　　标准管A

(四)参考值?

　　正常人TG水平高低受生活条件的影响，有随年龄上升趋势。营养良好的中、青年平均值约0.9—1.0mmol／L(80—90mg／L)；老年平均值超过1.13mmol／L(100mg儿)，数据分布明显偏态。95百分位数在中青年约1.69mmol／L(150mg／d1)；老年2.26mmol／l(200mg／出)。一般以2.26mmol／l以上为增高，美国人定2.80mmol／L(250mg／d1)以上为增高。

(五)附注

1．本法的主要问题是测出的结果中包括游离甘油。正常人空腹血清含甘油平均约0.1lmmol／L，有人主张在TG测定中扣除这一固定值，在健康检查与流行病学调查中是可行的，但在某些病理状态下(如糖尿病酸中毒)游离甘油可能明显增加，AC最好有单独测定甘油的对照管；这样要增加工作量与昂贵的试剂费‘有人用两步加试剂的办法，第一试剂中不含LPL与4AAP。待标本中甘油耗尽后，再加入LPL与4AAP。但目前多数酶试剂盒的方法不减去游离甘油，结果高于化学测定法。

2．本法中三种主要酶的最适pH不同。选用pH7.6的原因是为了加速反应(室温下10分钟也能完成)，显色稳定性最好。在Tris缓冲液中反应比用磷酸盐缓冲液快。胆酸与表面活性剂可促进TG水解。镁离子是GK的激活剂。

3．本法的线性范围可达22.6mmol/L（2000mg/dl），但应血清TG过高时，测定中难免受标本混浊的影响，故在TG11.3mmol/L(1000mg/dl)以上时，应减少标本用量或稀释之。

4．对指示反应的干扰因素同TC测定。GPO纯度不高，会因混杂的其他氧化酶的作用，产生额外的H2O2而使结果偏高。

5．本法批间CV<3％，优于化学法。

五、发展中的检查项目

　　除了上述推荐的替代方法以外，需要补充的是血清(浆)载脂蛋白(apo)测定。apo是脂蛋白颗粒外层的蛋白质部分，它有维持脂蛋白结构与脂类运输，调控脂代谢有关酶的活力以及识别脂蛋白受体等重要功能。在已经分离出的许多apo中，主要的有apoAI、All、B、CI、CII、CIII、E及apo(a)等，用作心、闹、脑血管病危险因素指标的是apoAl、apoB及apo(a)等三项，后者以含apo(a)的脂蛋白Lp(a)表示。

　　apoAI与apoB分别为HDL与LDL的主要蛋白质。通常认为HDL是动脉粥样硬化的防御因素而LDL是致病因素，所以apoAI减少或／及apoB升高提示动脉粥样硬化发生的危险性增加。人血清中Lp(a)水平决定於遗传因素。流行病学与临床研究指出，高水平(Lp(a)是冠心病与脑血管病的独立的危险因素，与其他脂类和脂蛋白水平无明显相关。

　　替代试验中所说的HDL与LDL测定方法是测定其所含的胆固醇(HDL-C与LDL-C)，但是胆固醇只是脂蛋白大颗粒中的一种组分。在病理状态下，脂蛋白的脂质组成会有较大变动，所以LDL-C与apoB水平的高低变化不一定是相应的。冠心病人apoB增高比TC与LDL-C明显，当有小颗的LDL增多时可以表现为apoB显著升高而LDL-C正常。HDL-C与apoA的水平高低也可能是不相应的，例如高TG时HDL-C往往降低，但apoAI不一定有同等程度的下降。总之，apo测定所提供的关于脂代谢的信息不是脂蛋白胆固醇测定所能替代的。

在测定技术上，HDL-C与LDL-C测定先要经过沉淀分离步骤，这一步容易引起误差，VLDL过高时也有干扰，且不便于自动化。apo测定采用特异性强的免疫化学方法，可直接用血清测定，有自动化大批量测定的方法。国内目前限于小范围内试用，具体方法可参阅其他有关文著或文献。

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