三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(29)
关于淘汰血清白蛋白盐析测定法
淘汰血清白蛋白盐析测定法的原因及替代方法
淘 汰 的 理 由
盐析是分离血清白蛋白与球蛋白最早采用的方法。高浓度盐类能改变溶液中蛋白质的静电荷和破坏蛋白质水化膜，使球蛋白聚集沉淀而使白蛋白仍保持在溶液中。起初，采用半饱和硫酸铵或23％硫酸钠沉淀剂，将血清分成白蛋白和球蛋白，再用双缩脲法或总氮测定法测定总蛋白和白蛋白。因部分球蛋白未被沉淀，其结果与蛋白电泳不一致，白蛋白相对偏高，球蛋白偏低。后来改用26％～28．2％硫酸钠或27．8％硫酸钠——亚硫酸钠作沉淀剂，其结果与电泳法较一致。但由于盐析分离明显地受盐浓度、温度、操作情况和标本中球蛋白浓度的影响，加之操作繁琐，使测定结果不稳定，准确性和精密度均差。现已有较好并可自动化的方法，故盐析法应予淘汰。
替代方法——澳甲酚绿结合法
血清白蛋白能与多种染料(指示剂)阴离子结合产生颜÷桓，使染料吸收峰转移。因白蛋白与染料结合能力很高，在过量染料存在条件下，白蛋白分子可全部与染料筇合。常用的染料有甲基橙，2(4＇-羟偶氮苯)-苯甲酸(HABA)，溴甲酚绿(BCG)和溴甲酚紫(BCP)等。其中采用最广的是BCG，其次是瑚BCP。BCG法操作简便(单一试剂法)，准确性较高，精密度好，适於自动化分析。现将AACC 1972年和1982的推荐的Doμmas血清白蛋白溴甲酚绿结合法介绍如下。
(一)原理
溴甲酚绿与白蛋白在pH4．2时反应产生的兰绿色复合、物，使染料的吸收峰转移，在628nm处吸光度与血清白蛋白浓度成正比。
(二)试剂
１、溴甲酚绿琥珀酸缓冲液(0．075mmol／L、pH4．2)? 取溴甲酚绿钠盐108mg，用lmol／L? NaOH40ml溶解后，加蒸馏水800ml，琥珀酸8．85g、叠氮钠100mg和30％Brij一35 4ml，溶解混匀后，用lmol／L NaOH调pH至4．2，蒸馏水稀释至1000ml(大批量配制可分装在500ml盐水瓶内，加橡皮塞，铝盖后高压灭菌，保存期一年以上)。
２、40g／L人(牛)血清白蛋白。
(三)操作
测定管和标准管分别加0．02ml血清和0．02ml 40g／L白事白溶液，各加溴甲酚绿琥珀酸缓冲液4ml，混匀并静置10·爷钟，以溴甲酚绿缓冲液调零，用0．5cra(或1cm)光径比色池爱~28nm处读取各管吸光度。
计算：
标本吸光度
血清白蛋白g/L＝------------×40
标准吸光度
线性范围：50g/L以下
参考值：38～48g／L以下。
(四)附注
１、实验证明BCG不但可与白蛋白反应，而且也能与血清中α，β球蛋、转铁蛋白、触珠蛋白和血红蛋白等产生缓慢反应Gμstafsson将BCG与白蛋白的反应称“快反应”(即时反应)，与其它蛋白反应称“慢反应”。正常人血清与BCG 10分钟反应结果产生相当於5g蛋白的非特异性反应，而白蛋白降低，球蛋白增高的患者此值可高达10g蛋白／L。为了减少非特异性反应，Corcoran将测定白蛋白的BCG反应时间定为10秒(自动化分析)，结果与免疫火箭电泳法一致。
２、标准问题?
推荐法系用人(牛)血清白蛋白作标准，但不能校正血清中非白蛋白与BCG反应产生的误差，故不少作者主张用血清作标准物，以校正BCG非特异性反应的干扰。已定值的白蛋白标准液标定作标准的血清，先用白蛋白与血清同时作电泳或BCG反应10秒，再算出血清的白蛋白值，这样标定可能得到较高的准确性。用低温乙醇法提取的纯人? (牛)血清白蛋白(CohnV)，聚合体可高达10％，可能影响显色反应。故不提倡应用。
３、BCG缓冲液的选择
Doμmas推荐pH4．2，0．075mmol／L琥珀酸缓冲液，灵敏度高，线性好。乳酸缓冲液灵敏度与琥珀酸相似；醋酸盐缓冲液次之；枸椽酸缓冲液灵敏度最低。
４、表面活性剂的应用
加入30％Brij35 4～6ml／L，吐温—姆0或吐温-80 2～4ml／L的试剂，线性和灵敏度均好，但浓度融高会使灵敏度明显减低。
５、比色波长
BCG与白蛋白结合，颜色吸收峰在682nm，6被长增高灵敏度缓慢降低，波长减低时灵敏度迅速下降。
６、BCG浓度与标本量的比例
推荐法BCG浓度为150mmol／L。缓冲液用量与加入标本量的比例为200，增高BCG浓度或降低此比例均使线性范围变小。
７、免疫化学测定法特异性高，为白蛋白测定的参考方法，如免疫扩散法，火箭电泳法等。这些方法需要特异性抗血清，手工操作，不适于常规使用。免疫浊度法(透射比浊法或散射比浊法)可用于自动化分析。但抗血清消耗量大，不经济。
８、BCP测定血清白蛋白的特异性高，无球蛋白反应干扰，为即时反应，显色稳定，与免疫测定法结果一致，是值得推广的方法，但与动物血清白蛋白结合力明显低于人血清白蛋白，所以BCP法不能使用动物牛血清白蛋白作标准或质控物。
