三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(41)
关于药敏试验的正确报告方式
采用正确的敏感试验报告方案
一、旧的报告形式缺乏严格的药效学定义
敏感试验是在体外测定病原菌对各种抗菌药物的敏感程度，为临床医生选择适当的药物治疗感染提供必要的依据。目前，临床常规实验室普遍采用琼脂扩散法敏感试验。80年代以前，国内几乎所有的实验室按四个等级报告敏感试验的结果。其标准是：抑菌环直径≥15mm，为高度敏感或极度敏感；抑菌环直径≥10mm且＜15mm为中度敏感；抑菌环直径＜10mm且＞6mm为轻度敏感；抑菌环直径等于6mm为耐药。实验室测定的结果如报告为敏感，在临床上就可以用该药进行治疗；如报告为耐药，在临床上便不能用该药进行治疗。然而，对于轻度敏感和中度敏感，当时出版的临床实验室手册和有关教科书均无明确的药效学定义。此外，该标准不分药物和细菌种类，也未考虑药物毒副作用的大小，一律按统一规定将敏感试验机械地分为四个等级，也是不合理的。
严格地说，按过去琼脂扩散法敏感试验的标准所报告的中度敏感和轻度敏感很难有实质性的区别，因为这种试验是定性实验而非定量实验(甚至做半定量都很困难)。作为一种生物学试验，其操作本身的变异相当大，一般允许抑菌环变动范围5—8mm。而按原标准的四个等级划分，每个级差约4mm。这样，实验本身的误差比级差还大。因此，这种级差的划分很不合理，据此所报告的结果不可避免地会有较大的误差，这点在划分轻度敏感和中度每感这两个等级时更为突出。此外，极度敏感的提法也不规范。根据以上理由，琼脂扩散法敏感试验，应基本上只分敏感和耐药两级，而对毒副作用较小因而临床可适当加大剂量的药物，则可另加中度敏感一级。
二、正确的报告方式
目前，国内实验室普通接受的方法是美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)介绍的琼脂扩散法敏感试验操作标准。该标准以敏感，中度敏感和耐药三个等级报告结果。对这三个等级，操作标准有明确的定义。
敏感(Susceptible)：指被测菌株所引起的感染可以用常规剂量的某种抗菌药物治愈。
中度敏感(Moderately
Susceptible)：指通过提高某种抗菌药物的剂量(如β-内酰胺类)或在该药物浓集的部位，细菌生长可被抑制。一般来说，对肠球菌，气球菌和非肠球菌，中度敏感需提高青霉素或氨苄青霉素的剂量。对于如心内膜炎这种严重感染须合用一种氨基糖苷类抗菌药才可有杀菌的效力。非肠球链球菌除个另抄卜几乎所有菌株对青霉素和氨苄均高度敏感。但对一个中度敏感的菌株应重复测定，如系心内膜炎，还应测其MIC。泌尿系感染可单独用氨苄青霉素或青霉素治疗。
耐药(Resistent)：指被测菌株所引起的感染不能用该抗菌药物治愈。
表1可报告中度敏感的药物和不可报告中度敏感的药物(中介)
| 中度敏感 | 中介 |
氨苄青霉素一测肠球菌 | 氨苄青霉素一测肠菌科 |
测链球菌 | 测葡萄球菌 |
先锋必素 | 苯性青霉素 |
青霉素G一测肠球菌 | 关孢羟唑 |
测链球菌 | 头孢唑啉 |
头孢噻吩 | |
先锋I号 | |
氯霉素 | |
氯林可霉索 | |
强力霉素 | |
红霉素 | |
庆大霉素 | |
卡那霉素 | |
氧呢嗪青霉素 | |
磺胺 | |
四环素 | |
青霉素G——测葡萄球菌 |
以上衡量被测菌株对抗菌药物敏感程度的三个等级，是临床实验室报告药敏试验结果的规范形式。
为了保证琼脂扩散法敏感试验结果的可靠性，并特别考虑到毒付作用较大的药物仅有“非此Bp彼”的敏感和耐药两个等级，在根据抑菌环直径解释敏感性时，NCCLS操作标准规定了一个抑菌环的缓冲区，称为中介。定义如下：中介(Intmediate)为一缓冲区，以避免微小的失控技术因素可能造成报告结果错误。抑菌环直径在中介范围内的药物，应视为或是敏感或是耐药。如确需用该药治疗，应重复试验或测其MIC。
由以上定义可见，中介是对抑菌环的定义，而不是对细菌敏感性的定义。所以，中介不能报告给临床医生。
关于中度敏感，必须注意只适于可加大给药剂量的药物。不少药物如氨基糖苷类，不能任意增加剂量，否则会产生严重的付作用。这类药物中度敏感没有实际意义，其报告结果只有两种形式：敏感和耐药。表1列出了可报告中度敏感和可有中介的药物。
表1．可报告中度敏感和不可报告中度敏感的药物
综上所述，琼脂扩散法敏感试验只能以三个等级发出报告，即；敏感、中度敏感和耐药。对于毒付作用较大的药物，则只能以敏感和耐药两个等级报告结果，中介是在此情况下为避免试验误差而设的抑菌环缓冲区，不能报告给临床医生。
三、琼脂扩散法药物敏感试验操作方法
琼脂扩散法敏感试验的基本原理是将含有一定量抗生素纸片或药片平贴在已经接种被测细菌的琼脂培养基上，纸片或药片中的抗生素即向周围扩散。敏感菌株在纸片周围的生长受到抑制而形成抑菌圈。依抑菌圈的大小判断细菌的敏感性。
根据琼脂扩散法敏感试验的原理，世界不少国家制定下标准化操作方莨：其中美国的原Kirby-Bauer法，经多单修订，比较规范，NCCLS定期发布经过修改的操作标准。除美国外，其它国家也看不少实验室采用，这里仅介绍这种方法。
（一）试验材料
１、培养基
Kirby-Bauer法指定Muller-Hinton琼脂。多年大皇的有关敏感试验的方法学研究均采用这种培养基。其在维持细菌正常发育，不拮抗抗菌药物活性及商品的批间差等方面均优手其它培养基。绝大多数细菌在泫培养基上生长良好。测肺炎链球菌的敏感性时，在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。测嗜血杆菌及淋病奈；瑟氏菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和2．5mg／ml辅酶1。加入后应校正pH7．2～7．4。
制备Muller—Hinton琼脂乎板应用直径90cm平皿。在水平的实验台上倾制。琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。琼脂凝固后，应测二下pH是否正确。琼脂平板应放4℃保存，在7日内用完。
２、药物纸片
抗菌药物纸片直径约为6．3mm，每片的吸水量约20μ1。采用NCCLS标准，纸片的药物含量必须与该标准规定的一致，不得任意吏改。药物纸片可以购买，也可自制，用前必须做质量鉴定。用以下两个指标判定纸片的质量：
（１）片间差：是衡量不同纸片含药是否均一的指标。测定方法：以标准菌株接种琼脂平板，一块平板上贴6张相同的药物纸片。35℃过夜培养后，记录6个抑菌环直径。其直径最大和最小之差不应太手1～2mm。
（２）准确度；判定纸片的实际含药量与标量是否一致。上述试验得出的6个直径，计算其平均值，结果与该药的质控标准比较，可初步判断准确度。准确度的进一步确认须通过日间的质量控制才可能得到。
确认质量合格的纸片才可使用，但如果纸片保存不好，有些品种的药效可很快下降。
纸片的正确保存十分重要。药物纸片必须在有干燥剂的容器内低温(—10℃以下)保存。只拿出少量放4℃备日常工作用。装纸片的容器从冰箱取出后，必须在室内温暖10分钟以上才可打开。如立即打开，空气中的水分会冷凝在纸片上，从而潮解。
临床实验室应按临床的需要决定敏感试验抗菌药物的种类。同类抗菌药物仅选用一个代表。应根据测定细菌的性质选药。
３、质控菌株
Kirby—Bauer法质量控制用菌株常规有三种，分别是金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922、绿脓假单胞菌ATCC27853。测定Muller—Hinton琼脂是否适合做磺胺药试验，还须用粪链球菌ATC-C29212或33186。国内质控菌株应由卫生部临床检验中心供应。实验室保存菌株可用冻干法或保存在高层琼脂中。用于常规质量控制的菌株应每月更换一次。
保证质控菌株不变异的简便方法：将新得到的冻干菌株接种Muller—Hinton平板复活。然后每株细菌接种10支高层琼脂管，放置室温保存。每月取出一支，传出细菌供常规用。待用剩至最后一支，再接种一批高层琼脂管备用。如此可保证原始菌种永不接触抗菌素。
４、菌液比浊管
为保证敏感试验的准确度和精密度，必须对接种菌液的浓度做相应控制。采用比浊的办法控制菌悬液浓度。接种菌液浓度为1．5X108／m1，浊度相当于麦氏比浊管第一号管的1／2。
比浊管配法如下：
048mol／2BaCl2 (1．175％W／V．BaCl2．2HzO) 0．5ml
0．18mol／2NH2SO4(1％．V／V) 99．5ml
将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀，有效期为6个月。
二、操作方法
１、制备接种菌液
临床标本中分离的细菌做药试验，应挑取分离平板上至少4～5个菌落制备接种菌液。用生理盐水制备菌液较好。取5ml无菌生理盐水置试管中，用接种环挑取菌落，悬于生理盐水中，振荡混匀后与菌液比浊管比浊，以有黑字的白纸为背景，调正浊度与比浊管相同。此法制备接种菌液适用于任何细菌。
２、接种平板
制备好的接种菌液必须在15分钟内使用。用灭菌的棉拭子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液。用拭子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60度。最后沿周边绕两．囵。保证涂均匀。
３、贴纸片
须待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，用镊尖压一下，使其贴平。纸片一贴就不可再拿起，因纸片牛的药物已扩散到琼脂中。每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。直径为90mm的平板最多贴6张。
贴上纸片后，须在15分钟内放35℃孵箱培养。不可放在COz2环境中
４、孵育
必须用35℃孵箱。平板在孵箱内最好单独摆放，不应数个叠在一起，否则会影响中间的平板；达不到孵箱温度而产生预扩散的作用。平板孵育18～24小时后，读取结果。
５、判定结果
培养后取出，测量抑菌环的直径。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺按药在抑菌环内会出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。
按抑菌环直径判断细菌的敏感性，必须依据表2所提供的标准。报告结果必须明确中度敏度和中介度的含意，加以区别。
（三）质量控制
１、质控方法
质量控制是用与常规实验相同的操作方法，测定质控菌株的抑菌环。应使用新鲜传代的菌种。接种菌液的涂布方法等均同常规操作，测定的抗菌素种类也应与常规测定的种类相同。按表3所列的数据测定相应菌株的抑菌环，并记录结果。
原来要求每天做质量控制。近年来，经过大量的工作实践，认为在实验条件恒定的情况下，每周测2次即可保证质量监测。如果发现失控，应立即改为每日监测。
２、抑菌环质控范围
表3列出了每种抗菌药物对四个质控菌株的抑菌环允许范围，这个范围为95％的可信限，即实验室日间质控得到的抑菌环直径，在连续20个数值中，仅允许有一个超出这个范围。如果经常有质控结果超出这个范围，说明实验方法不稳定。每日质控抑菌环直径的均值应接近允许范围的中间值，否则，操作中有不规范之处，应予以调正。
一旦发现失控，应从培养基，纸片、接种菌液等方面去查找原因，并及时纠正纠正。
