一例基因异常甲基化早期预测口腔白斑患者癌变病例分析
患者，女，61岁，2011年10月26日因发现口腔白斑1周来我科就诊。检查：15到17，27腭侧牙龈分别可见大小1.5 cm×2 cm、1 cm×1.5 cm的灰白色斑块，表面略粗糙、微突出于黏膜表面、质韧、边界不规则、界清、无触痛；14到26腭侧龈缘可见条带状的浅白色斑块，部分连接成片、界清、无触痛、均质；17腭侧可见0.3 cm×0.3 cm充血区，无触痛。临床初步诊断：口腔白斑。
血常规无明显异常。组织活检：于17腭侧病损处取病理，病理组织沿长轴一分为二，一半用于病理检测，另一半提取DNA，用于甲基化基因芯片分析和肿瘤抑制基因P16、P15、RASSF1A、RASSF2甲基化状态检测。病理诊断：白斑苔藓样变伴上皮轻-中度异常增生（图1）；因组织炎症细胞多，进一步免疫组化染色以确定炎症细胞来源，CD3约60%以上为T细胞来源；CD20约30%～40%为B细胞来源（图2，3）。
基因甲基化芯片检测：使用QiagenDNA提取试剂盒提取DNA，进行Illumina人全基因组甲基化芯片（450K Infinium Methylation Bead Chip）分析，其可在单个CpG位点水平提供定量DNA甲基化分析，是目前分辨率最高的表观遗传学研究芯片。该患者芯片基因甲基化谱与另外3例口腔鳞癌患者极其近似（图4），提示该患者癌变的可能性很大。
抑癌基因甲基化状态检测：使用内切酶消化法和实时定量PCR对这P16、P15、RASSF1A和RASSF2抑癌基因进行甲基化状态检测，患者的P16、P15、RASSF1A、RASSF2甲基化阳性率分别为10.88%、21.92%、26.10%和26.30%，与正常人相比显著增高，与口腔癌患者一致。患者2014年5月8日复诊，临床检查：13到17腭侧龈可见白色云雾状病损，轻度充血，未见白斑。25到27牙槽嵴黏膜可见白色斑块。27远中及上颌结节可见白色斑块，表面凹凸不平。血常规无明显异常。
组织活检：于27腭侧黏膜取病损组织，病理诊断：白斑伴复层鳞状上皮中-重度异常增生（图5）。
讨论：
口腔白斑是重要的口腔黏膜癌前病变，早期判断白斑是否有癌变倾向对于患者的预后非常关键。DNA甲基化对生命过程起到非常关键的作用，是基因精确调控的方法之一。在哺乳动物基因中，大部分的DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化。
DNA甲基化是基因外修饰，不改变DNA的一级结构；它在细胞正常发育、基因表达模式及基因组稳定中起着至关重要的作用。基因的异常甲基化与很多疾病密切相关，肿瘤组织中抑癌基因的甲基化在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。P16、P15、RASSF1A和RASSF2是4种已知的重要抑癌基因，正常组织呈非甲基化状态，在癌变组织中呈异常高甲基化状态。
有研究表明P16、P15、RASSF1A和RASSF2的异常甲基化发生在口腔黏膜癌变的早期，异常甲基化可导致抑癌基因失活从而引起癌的发生，且P16、P15、RASSF1A和RASSF2均失活的口腔癌患者预后更差。我们曾经对87例白斑、39例口腔癌与20例正常口腔黏膜进行研究，同样发现P16、P15的甲基化在口腔癌前病变组织中显著增高，说明P16、P15在口腔黏膜癌变发生的早期起重要作用，可作为口腔黏膜癌变的早期标志物。
本例患者初诊时P16、P15、RASSF1A和RASSF2甲基化阳性率，与正常人相比显著增高（正常患者黏膜的甲基化率<3%）。时隔2年半复诊，病理结果由白斑轻-中度异常增生发展为中-重度异常增生；再次证实P16、P15、RASSF1A和RASSF2具备早期预警口腔黏膜癌变的作用，是口腔黏膜癌变的早期标志物。临床中一旦发现患者P16、P15、RASSF1A和RASSF2发生异常甲基化，应密切关注该患者病损的变化，缩短复诊时间，如病损发生变化应更积极应对。
