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三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(30)

2021.4.26

关于淘汰血、尿淀粉酶温氏测定法

淘汰血、尿淀粉酶(AMS)温氏测定法的理由及替代方法

淘　汰　的　理　由

　　淀粉酶是一类能将淀粉分子水解的酶。人类的淀粉酶属于。淀粉酶，或称内切淀粉酶，有任意．切割α-1，4糖苷键的能力，作用于多糖后可产生葡聚糖、麦芽糖和葡萄糖分子。测定淀粉酶的方法很多，有粘度法，浊度法，糖化法，淀粉——碘量法，染料释放法等。前二者由于影响因素较多，缺乏特异性和灵敏度，已被淘汰。糖化法虽然可直接测量酶活性，但操作复杂不适用于临床常规检查。目前应用较为广泛的为碘量法，酶速率法和染料释放法等。温氏法是基于碘量法原理的一种半定量方法。

　　做为一种测定淀粉酶活性的方法，目前认为最好具备下述几个条件，即：应用性质稳定的限定性底物；有好的限定性反应产物；在30℃反应时有足够的灵敏度；没有内源性葡萄糖干扰等。从这些条件来看，温氏法是不符舍要求的。它以测定剩余底物反映酶活性，对淀粉的要求没有限定性规格，用生理盐水稀释而非缓冲液亦不符合酶学测定要求，肉眼观察颜色来判断结果，只能属于半定量方法，不能准确与精确的反映酶活性。此法不敏感，淀粉酶升高的阳性率低於酶法和染料衫，易给临床造成误诊。因此，在有许多更为灵敏且特异方法的情况下，温氏法已失去其实用价值。

可　替　代　的　方　法

　　目前应用的有碘淀粉比色法，酶法与染料释放法等。后二聿试剂配制困难，但已有商品试剂盒供应。现将此三种方法介绍于下。

一、碘淀粉比色法

（一）原理

　　血清(或血浆)中α-粉酶催化淀粉分子中。α-1，4葡萄糖苷链水解，产生葡萄糖，麦芽糖及含。α-1，6糖苷键支链的糊精。在已知底物浓度的条件下，反应后加入的碘液与未被水解而剩余的淀粉结合成蓝色复合物。其蓝色灼深浅与未经酶促反应的对照管比较，即可推算出淀粉酶的活力单位。

（二）试剂

1、4g/L缓冲淀粉溶液

　　于约500ml蒸馏水中，溶解9g氯化钠，22．６g无水磷酸氢二钠（或56.94g Na2HPO4。12H2O）和12．5g无水磷酸二氢钾。加热至沸。另取一小烧杯，精确称取0．4g可溶性淀粉，加入约10ml蒸馏水，使溶液成糊状后，加入上述沸腾之溶液中，水洗烧杯一并倒入。冷至室温后，加如37℃甲醛溶液5ml，用蒸馏水稀释至1L。此溶液pH为7．0±0．1，应置冰箱保存。

２、０．１mol／L碘贮存液

　　于约400ml蒸馏水中溶解1．7835g碘酸钾(KIO3)及22．5g碘化钾(K1)，缓慢加入4．5ml浓盐酸，边加边搅拌，用蒸馏水稀释到500ml，充分混匀，贮淙色瓶，置冰箱保存。

３、0．01mol／L碘应用液

　　取碘贮存液，用蒸馏水稀释10倍，贮棕色瓶，置冰箱可用一个月。

（三）操作

　　血清先用生理盐水作10倍稀释后，按表1操作。

　　表1　碘淀粉比色法测定淀粉酶操作步骤

	测定管（Μ）	对照管（B）
缓冲淀粉溶液（ml）（37℃预温5分钟）	1．0	1．0
稀释血清（ml）	0．2
混均，置37℃水溶中准7．5分钟
碘应用液（ml）	1．0	1．0
蒸馏水（ml）	6．0	6．2

　　混匀，于600nm波长处，用10mm光径比色杯比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光度。

　　单位定义：100mi血清中的淀粉酶在37℃15分钟水解5mg淀粉为1个单位。

　　计算：淀粉酶单位＝

　　参考值：血清80—180单位，尿液100—1200单位。

（四）附注

1、草酸盐、枸椽酸盐、EDTANa：及氟化钠对AMS活性有抑制，肝素无抑制。

2、酶活性在400单位以下时与底物的水解量成线性。如测定管吸光度小于空白管吸光度一半时，应将稀释血清再行稀释，测定结果乘上稀释倍数。

3、本法亦适用于其它体液淀粉酶的测定。尿液先作20倍稀释后测定，其参考位为100—1200单位。

4、唾液含高浓度淀粉酶，须防止污染。

5、淀粉溶液若出现混浊或絮状物，表示淀粉溶液受污染或变质，不能再用。

二、酶速率法

　　本类方法中有以合成色素原做底物的方法，也有用辅酶一脱氨酶做指示系统的紫外监测法。操作方法均应按试剂盒说明进行。现以某一试剂盒为例，做一介绍。

（一）原理

　　所形成硝基苯酚在405nm波长有最大吸收。硝基苯酚形成的速率与血清(或尿液)中淀粉酶的活性成正比。测定405nm波长下吸光度增加的速率，即可测出淀粉酶的活力。

（二）试剂

名称	主要成分	实验浓度
试剂Ⅰ(RI)(片剂)	α-葡糖苷酶	≥30μ/ml
	P-硝基苯麦芽庚糖苷	5mmol/L
试剂Ⅱ(RⅡ)	磷酸缓冲液	100mmol/L、pH7.1
	NaCl	50mmol/L
工作液	将一片RI放入2mlRⅡ中，使其完全溶解，即为工作也。适用前预热到测试的温度

　　试剂复溶前在2—8℃保存，可稳定至标签上注明的日期。复溶后在2—8℃，可稳定2天。在15—25℃可稳定8小时。

（三）操作

　　样品可用血清、肝素抗凝血浆或尿液(表2)

　　表2　酶速率法测定淀粉酶操作步骤

工作液	2．00ml
血清或血浆	0．05ml
尿液	0．02ml

　　混合均匀后，倒入比色杯。在37℃保温3分钟，读取初始吸光度，同时开始计时。在精确计时的1、2、3分钟时，分别读取吸光度。

　　确定每分钟的平均吸光度变化(△A／分钟)，并用它进行计算。

　　计算：血清、血浆AMS(Μ／L)＝11604△A405nm／分钟
　　　　　尿液AMS(Μ／L)＝28585X△A405nm／分钟
　　　　　P-硝基苯酚毫克分子消光系数＝1．1777
　　　　　　　　　　　　　2.05
　　　　　血清因数计算＝-----------------×100
　　　　　　　　　　　　0.02×1.1777×3
　　　　　　　　　　　　

　　　　　　　　　　　　　2.02
　　　　尿因数计算＝-----------------×100
　　　　　　　　　　　0.02×1.1777×3

　　当分析24小时尿液时，利用以上公式，并将结果乘以在24小时内收集的尿液的体积。

　　如用ZS-1型半自动生化分析仪，可用下列参数进行：
　　样品量　　　　　　　　　　　　　　15μl
　　试剂量　　　　　　　　　　　　　　600ml
　　反应温度　　　　　　　　　　　　　37℃
　　波长　　　　　　　　　　　　　　　405nm
　　延迟时间　　　　　　　　　　　　　180秒
　　测量时间　　　　　　　　　　　　　20秒
　　计算因数　　　　　　　　　　　　　28585

　　参考值
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　37℃
　　血清，血浆　　　　　　　　　　　　＜220U／L
　　随意尿　　　　　　　　　　　　　　＜1200U／L
　　24小时尿液　　　　　　　　　　　　＜1100U／24h

（四）注意事项

1、如果在3分钟测量时间内，吸光度变化△A/分钟超过0．150，则用1．0ml? 0．9％NaC1溶解稀释0．1ml样品，再重新测定，结果乘以11。

２、如果测定不能在405nm波长下进行，则必须使用P—硝基苯酚校正溶液制定标准曲线。

３、血红蛋白浓度高达250mg／100ml(0．124mmol／L)时不影响测定。

４、试剂Ⅱ中含叠氮钠作为稳定剂，应避免与皮肤或粘膜接触。

５、底物反应释放出来硝基苯酚有毒，不要吸入其蒸汽并避免与皮肤接触。如果溶液与皮肤接触，立即用聚乙二醇400或用大量水冲—洗。

６、如果使用自动生化仪进行测定，可根据以上提供的样品与试剂之比，及延迟时间、线性时间这三个基本参数，按照所使用仪器的程序要求编制具体实验条件。

７、本试验亦可在25℃与35℃下进行，但需加大样品量，改变计算参数。

三、染料法

　　有不同种类的染料与结合底物。染料试剂片多由商品提供，应按试剂盒操作说明进行试验。现以某商品试剂为例加以介绍。

（一）原理

　　此试验为半合成底物法。即将天然淀粉经过1．4-Butanediol diepoxide键合形成不溶性淀粉，再与兰色色素(Cibachror Blue F3GA)结合形成兰色淀粉聚合物。在α-淀粉酶作用下，底物中1，4糖苷键被切断，脱落下可溶性的小分子兰色淀粉聚合物，因而溶液的兰色深浅与淀粉酶活性相关，可用以求出α-淀粉酶活性。

（二）试剂

1、淀粉色素片
2、酶标准液
3、 0．5N NaOH

（三）操作

1、样品(血液或尿液)操作(表3)

　　表3　染料释放法测定淀粉酶的操作步骤

	血清测定管	尿液测定管	空白管
血清(μl)	100
尿液(μl)		50
蒸馏水	4	4	4
淀粉试剂片	1	1	1
旋转振荡10秒钟，使试剂片充分溶解。在37℃水浴中，血液孵育30分钟，尿液15分钟。
0．5N NaOH(ml)	1	1	1

　　3500rpm／分离心5分钟，取上清在620nm处，以空白调零，读取吸光度，即可从标准曲线上查得结果。尿液结果需乘以4求得。

2．标准曲线制作法(表4)

　　表4? 标准曲线制作

试管号	1	2	3	4	5	6	空白
酸原液（ul）	10	20	50	100	200	400	0
蒸馏水（ml）	4	4	4	4	4	4	4．1
试剂片	1	1	1	1	1	1	1
同血清操作
液量修正系数	5．01/5．1	5．02/5．1	5．05/5．1	5．1/5．1	5．2/5．1	5．4/5．1	1
相应酶活性*	—	—	—	—	—	—	—