三十五项淘汰临床检验项目、方法及替代实验(34)
关于淘汰血清甲胎蛋白对流免疫电泳法和单扩散法
淘汰血清甲胎蛋白测定对流免疫电泳法和单扩散法的理由及替代方法
甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是胎儿肝脏和血清中的一种蛋白成份，在电泳图谱上位于白蛋白与α1球蛋白之间，故名。正常人血清中AFP含量极微，一般在30ng／m1以下。80％以上原发性肝细胞癌患者血清AFP升高，明显者超过200ng／m1。因此，血清AFP被作为肝癌的诊断标志而在临床检验中进行检测。检测方法根据敏感度不同可分为两大类。一类敏感度较低，其代表为对流免疫电泳法(敏感度100～300ng／m1)和琼脂免疫扩散法[包括火箭免疫电泳法(敏感度350～2000ng／ml)]。这一类检测方法在方法学上无特殊之处，均以抗AFP血清混入琼脂凝胶板内，在板上打孔，加入受检血清，进行免疫扩散或电泳，肉眼观察沉淀线条以判断结果。对流电泳为定性试验，火箭电泳可作定量测定。两者的缺点为敏感度太低，因而不能发现早期或血清AFP含量较低的肝癌。另外，如血清AFP含量过高，在对流电泳中可出现假阴性。这类方法用于临床检验易引起漏诊和误诊，应予以淘汰。
另一类方法敏感度较高，包括反向间接血凝试验，放射免疫测定，放射火箭电泳自显影，酶免疫测定等。如试剂质量符合要求，检测敏感均可达20ng／ml以下。这些方法均适用于肝癌的辅助诊断，国内亦有试剂盒供应，可根据实验室的条件和可得到的试剂的质量而选择应用。以下推荐固相酶免疫测定法。
固相酶免疫测定法(ELISA)
一、原理
为ELISA双抗体夹心法技术。将抗AFP抗体包被ELISA反应板微孔，加受检血清标本，再加酶标记抗AFP抗体和酶底物。标本中如含有AFP，出现呈色反应，呈色深浅与AFP含量呈正相关。
二、试剂
有试剂盒供应，由以下各组份组成。
已包被抗AFP抗体的ELISA板。
辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗AFP抗体。
HRP底物。
酶标抗体稀释液。
洗涤液。
AFP参考标准液(定量测定用)。
阳性和阴性对照血清。
三、操作
因试剂盒组成的不同，在操作细节中可有差别。应严格按试剂盒所附说明书操作。基本步骤为下：
洗涤反应板? 用洗涤液洗涤已包被AFP抗体的ELISA板。洗涤方法按说明书规定。
加受检标本和参考标准液(定量测定)及阴性、阳性对照血清，每孔加样100μl。受检血清及对照血清均不稀释。定量测定中参考标准液浓度一般为：0、5、10、25、50、100、200、400ng／ml。置37℃水浴箱保温l小时。吸干各孔液体，洗涤3次。
加酶标抗体应用液? 按说明书配制酶标抗体应用液，每孔加100μl。置37℃水浴箱保温45分钟。吸干各孔液体，洗涤4次。
加底物液? 按说明书配制底物液。常用的底物液含H202：和磷苯二胺(OPD)，应现配；避光。每孔加100μl。定量测定置37℃水浴箱15分钟。定性测定置室温5—15分钟。加2mol几硫酸25μl终止反应。
比色：（１）定性测定：肉眼观察各孔呈色情况。底物空白和阴性对照孔应为无色或浅淡棕黄色。标本孔颜色深于阳性对照孔(30ng／ml)的结果为阳性。
（２）定量测定：用酶标仪进行比色。在波长492nm处读取各浓度标准孔及各标本孔的吸光值。以AFP浓度为横座标，以吸光值为纵座标，在半对数座标纸上绘制标准曲线。以测定孔的吸光值在标准曲线上查出相应血清标本的AFP含量。
<ｐ> 四、参考值
正常人血清AFP含量低于30ng／ml。
五、临床意义
原发性肝细胞癌患者80％以上血清AFP升高。其他肝脏疾病如病毒性肝炎等，亦可出现血清AFP轻度升高，应注意鉴别。常以AFP含量＞200—400ng／ml作为肝癌诊断的临界值，但早期肝癌患者血清AFP可仅高于正常参考值。睾丸癌患者血清AFP亦升高。孕妇血清AFP含量高于正常，怀孕13到15周达最高值，随后逐渐下降。胎儿患神经管缺损等畸形的孕妇，其血清AFP含量明显高于怀正常胎儿的相同孕期的孕妇。
六、附注
ELISA实施中影响因素甚多。应熟悉ELISA基本方法和各步操作中的注意事项，严格按规范操作，不可任意简化。
应注意所用试剂盒的质量。
定性测定试剂盒有用一步法的，即受检标本和酶标抗体同时加入。酶底物更宜采用四甲基联苯胺(TMB)，试剂更稳定，阴性本底浅，阳性呈蓝色，肉眼易于判别。
