液相色谱使用者必须谨记的秘诀（二）

2020.2.22

关于色谱柱的使用和维护

　　色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。

　　调节流速太快

　　避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓(如前所述)。

　　反冲色谱柱

　　一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

　　预柱和保护柱

　　选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。

　　避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。

　　【来自前辈的经验】小概率故障如何排除？

　　【1】泵压跳动，跳动范围10bar左右。。。

　　解决方法：

　　1、原先小白头有点脏，更换后尚未解决;

　　2、将主动阀上的阀芯取出后，发现有类似气泡存在，浸入甲醇-水溶液超声5min，以试着去除气泡，重新将其安装后再观察，仍未解决;

　　3、更换新的阀芯，将其安装后，不再有跳动，观察一段时间后比较平稳，成功解决。

　　【2】发生故障：

　　①plug homing over pressure

　　② 灌注及设流速时均无压力也不见液体流出

　　③检测器光闸不能复位④进完大浓度样品后，进空白相应位置也出峰。。。

　　可能原因：

　　①在线过滤器堵了

　　②泵头下单向阀堵了

　　③有可能是检测池脏了，也有可能是光路有点堵，再不行可能是灯寿命到了

　　④小抹布脏了，需要换

　　解决方法：

　　①在线过滤器卸下来，置烧杯，加纯化水煮沸5-10分钟后甲醇超一下一般就可以了，如果还堵的话就拿稀硝酸泡，还不行的话就换新的了，这本身是个消耗品

　　②把泵头下单向阀卸下来，两个都有可能堵，刚卸下来时竖着在耳边摇一摇是听不到声音的。简单的拿洗耳球把单向阀吹吹就行了(注意方向)，吹了没反应可以拿溶剂超声，但不可水煮，一般超至在耳边摇能听见声音就不影响实验

　　③先用溶剂把检测池冲冲，用啥试具体样品而定;若冲了还不行，把检测池卸下，看灯能量，若能量还可以(有个几千)，可能得清洗光路了。第一次清洗的话建议还是叫工程师来，因为待清理的部件在检测器的最下方，有一个黑色片片，中间有一条缝，而且那一块的螺丝都是八角的，卸起来很麻烦。

　　④把5个样品盘都拿出来，可以看见里面有一个黑色突起(看不清用手电筒)，平时进样针就是从那个地方吸样的。手伸进去就可以卸下来，里面有一个小白圈圈(用多了自然就黑了)，换一个新的就行了，买仪器时一般配有10个。

　　液相色谱在使用过程中的四大关键因素

　　1.液相色谱仪本身：

　　对于仪器本身一般不会有问题，特别是刚买回来的新仪器。对于仪器本身最重要的就是仪器的校验，刚买回来的仪器一般都是由卖家先对仪器做系统的确认工作(包括IQ、PQ、OQ)，确认顺利通过后，再请国家或省级仪器检定局的来校验，检定合格后就可以放心使用了，除此之外，一些做得好的公司每半年会对仪器进行一次的内部校验，目的就是为了保证仪器的正常可运行状态。

　　2.色谱条件：

　　色谱条件一般包括流动相、色谱柱、检测波长、流速及进样量。流动相就涉及到配制流动相所用到的水和试剂试液，水一般要求用超纯水或其他水的电阻率不大于18.2兆欧级别，试剂试液要求用色谱级别的，原因为防止水和试剂试液中的杂质对色谱结果的干扰。色谱柱会因不同的品种而有不同的要求，但每根色谱柱都有它的清洗要求，这个在色谱柱说明书上都可以找到，一定要根据上面的要求进行，否则会造成色谱柱效下降和色谱柱的使用寿命缩短，检测波长也会因品种的不同有不同的要求，这里需要指出的是要注意观察检测器氘灯能量的变化，比如基线波动大，活性成分的响应值突然变小等，都有可能是氘灯的能量不足所引起的，氘灯一般建议使用800小时，但实际上使用时间不止，可根据实际情况更换。流速也因品种的不同而不同，一般为1.0ml/min，流速是不可随意改动的，特别是作为QC人员，但是作为研发人员，有时为了摸索条件或进行方法耐用性验证，会对流速进行改变以评价方法的适用性。对于进样量因不同的品种也有不同规定，进样量这块现在都使用自动进样，所以进样精密度都很好，不需强调什么。

　　3.操作人员：

　　首先，作为液相操作人员，一定要认真学习夜想的说明书，掌握液相硬件和软件的操作，掌握日常的维护保养，掌握最基础故障的排除和维修。一般液相的操作规程也是有操作人员起草的，所以只要严格按照操作要求进行操作，一般不会出现问题，当然啫喱需要特别指出的是对于液相的日常维护保养很重要，比如流动相的过滤、脱气、泵密封垫的清洗、系统管路的清洗、溶剂过滤头的清洗等，倘若不坚持，很容易导致色谱柱堵塞、系统压力过大、色谱峰异常等不必要的故障，浪费时间。其次，操作人员在配制液相分析用样品溶液时，最好由同一个人单独完成，以免不必要的偶然误差。

　　4.液相安装环境：

　　液相色谱仪应尽量安装于水平、远离振动、电磁干扰的屋内的台面上，有条件的话尽量将液相数据处理系统分隔开，一个是防止色谱基线噪音偏大，基线不稳等，一个是为减少对人体的危害。

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