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【基因编辑】CRISPR加速助力类器官研究，探索疾病机制

赛默飞生命科学

2023.6.05

Dr. Yu Holly Chen，阿拉巴马大学伯明翰分校助理教授

Dr. Rinki Ratnapriya，贝勒医学院助理教授

全世界约有22亿人患有视力障碍，年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人失明的主要原因，该疾病主要由视网膜黄斑区感光细胞死亡引起。全基因组关联研究（GWAS）揭示AMD中涉及许多常见基因变异体。然而，由于缺乏准确模拟正确疾病背景的合适疾病模型，理解这些变异体的潜在机制的努力受到了阻碍。

类器官是来源于干细胞的自组织三维细胞模型，它让复制人眼以仔细检查和研究视力丧失成为可能。现在，这些模型正与最新的CRISPR技术相结合，引入精确的基因编辑，以检查单个变异体在视网膜神经变性机制中的作用。

在本次SelectScience®采访中，我们与阿拉巴马大学伯明翰分校助理教授Dr. Yu Holly Chen以及贝勒医学院助理教授Dr. Rinki Ratnapriya进行了交谈，以了解他们如何将各自在开发视网膜疾病体内模型方面的专业知识相结合，采用基于测序的全基因组方法来推进我们对AMD疾病机制的认识，并探索潜在的治疗方法。

接近导致基因问题的原因

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全基因组关联研究已鉴定出34个与AMD相关的位点。然而，由于这些变异体大多位于基因组的非编码区，识别致病变异体、靶基因及其介导疾病表型的机制仍然面临重大挑战。

视网膜类器官广泛模拟人类视网膜的发育和形态，提供了一种手段来探索疾病机制和体外进展，研究单个AMD相关变异体的作用。Ratnapriya解释道：“由于人类有许多不同的变异体，在实验室培养的细胞中研究这些变异体为研究疾病机制提供了一个独特的窗口。这促成了我们与Dr. Chen的合作，她是开发视网膜疾病体内模型的专家。”

Chen的研究主要集中在遗传性视网膜变性，具体而言，遗传突变如何导致眼睛内感觉结构（称为原发性纤毛）的缺陷。她表示：“我们使用来源于人类多能干细胞的视网膜类器官，它们形成微型三维组织，在结构和某种程度功能上类似于体内视网膜。这些提供了一个有希望的平台，以研究疾病机制和开发人类背景下的治疗方法。”

Chen继续说道：“Rinki和我都在美国国家眼科研究所（NEI）的同一个实验室完成博士后研究，我们的专业知识和研究兴趣有很强的互补性，通过合作，我们希望将这一基于人类多能干细胞的平台与基因组技术相结合，以提高我们对AMD的认识，探索各种治疗方法。”

免疫染色人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜类器官

©阿拉巴马大学伯明翰分校

同基因类器官的CRISPR工程

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Chen和Ratnapriya的合作旨在揭示非编码变异体调节可能在AMD中起作用的基因表达的机制。为此，研究人员计划生成同基因类器官模型——具有相同基因组成的细胞系，但不包括感兴趣的特定基因修饰。Ratnapriya称：“我们计划使用CRISPR基因编辑产生具有AMD相关变异体的同基因细胞系。通过这样做，我们希望研究这些变异体对基因表达、调节网络和疾病机制的长期影响。”

Ratnapriya接着解释了CRISPR技术在这项工作中的价值。她说道：“基于CRISPR的基因编辑、基因激活（CRISPRa）以及基因抑制（CRISPRi），提供了一系列策略来研究疾病相关细胞系中携带致病变异体的调控元件，以研究它们的功能、靶基因以及在导致疾病表型中的整体作用。”

“与TALEN等其他基因组编辑工具相比，CRISPR是一种更通用、更容易设计的方法，”陈补充道，并指出CRISPR技术的进步极大地简化了人类疾病的同基因体外模型的创建。

她还补充道：“除了与Rinki的合作，我还使用CRISPR工具生成同基因和条件敲除hPSC衍生模型，以分析特定基因和细胞类型在疾病进展中的作用。”

实验挑战

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尽管基于CRISPR的基因编辑在精确度和效率上有所提高，Chen和Ratnapriya的研究也面临挑战。Ratnapriya表示：“像大多数复杂的疾病一样，AMD也是由多种致病变异体的累积影响引起的，在细胞培养中建模在技术上仍然具有挑战性。使用CRISPR对候选基因进行跟踪还需要事先了解哪些功能检测与疾病最相关，而这些知识并不总是很容易理解。”

Chen补充道：“一些研究人员不愿使用基于CRISPR的基因编辑工具，因为他们担心脱靶效应或其他陷阱，我理解这些是该方法目前的缺点，但重要的是要记住，每种新技术都有初始困难，这些困难可以随着时间的推移得到解决和改善。例如，现在已经开发了不同的Cas9蛋白种类，以降低脱靶效应，提高效率。如果我们不尝试新的东西，就不会有任何改进。”

基因编辑的未来

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除了开发疾病模型之外，Chen和Ratnapriya还认为在治疗应用中使用CRISPR Cas9介导的基因组编辑具有很大的前景，可能用于纠正与人类视力丧失相关的致病突变。“随着效率和特异性的提高，在未来，我们可以直接将基因编辑装置注射到疾病相关的组织中，在位点进行突变，”Chen兴奋地说。

Ratnapriya补充道：“在人体中应用基因编辑技术存在一些挑战，如脱靶、多态、递送方法优化和伦理。然而，基因编辑方面的技术进步为预防、治疗和治愈遗传性疾病提供了一个真正的机会。”

她继续说道：“基因编辑加速了基因表达调控、表观遗传修饰、治疗药物开发、功能基因筛选和基因诊断方面的研究，将基因组编辑用于疾病预防和治疗的长期目标仍然十分具有吸引力，我对其他研究人员的建议是，继续突破极限，提出相关问题，使基因编辑成为下一代治疗选择。”

类器官和CRISPR基因编辑：获得成功的工具

在进行基于类器官和CRISPR Cas9的研究时，使用高质量的试剂非常重要。Chen使用Thermo Fisher Scientific提供的培养基、生长因子和试剂开发类器官模型。

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点击阅读原文了解更多关于其解决方案的信息。了解更多关于CRISPR基因编辑技术如何支持研究人员的工作：

ISCIII罕见病研究所人类疾病果蝇模型团队负责人Dr. Sergio Casas-Tintó将CRISPR基因编辑与替代动物模型相结合，以揭示导致罕见病和超罕见病的基因。
威斯康星大学麦迪逊分校生物医学工程副教授Dr. Krishanu Saha强调了CRISPR在提高CAR T细胞治疗实体肿瘤方面的潜力。

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周锦帆