酶标仪操作

2019.10.31

1. 注意事项

1）反复研读试剂盒说明，熟悉操作步骤。

2）加样的准确性。操作中须注意显色剂和终止的加量准确，最好使用加样枪加液以保证比色时吸光度的准确性。枪头不要混用。

3）洗涤时间。一般按照说明书要求，起码洗涤5次，切要把残液甩干。

4）观察和判读吸光度结果应在15min 内完成，否则液体颜色会减退。

5）待测生物样品要放在4℃冰浴上。

6）显色液要现用现配，避光低温保存。

7）注意购买抗体的保存。

2. 酶标板材料

可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板。由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。

国产聚苯乙烯微量反应板（上海塑料三厂出品）目前已大量应用于ELISA测定，并且获得了满意的结果。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚至完全丧失吸附能力。

对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定，鉴定的方法和标准是对每批购置的微量反应板抽样，用检测试剂盒进行试验，当显色并终止反应后，在酶标比色计中测定其O.D值。

一般认为全板中每两孔间O.D值的误差不超过10%为合格。如果中间孔与四周孔O.D值相差太大，或者反应板的这一边与另一边凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，还要检查阳性和阴性参考血清O.D值是否有明显差别。一般要求有10倍左右的差异为合格。

一般的酶标仪在测定中均有单波长和双波长的模式，为什么呢？

酶标仪是垂直光路，受被测样本液面是否水平、酶标板透光性、孔底是否平整等的影响较大。

选择 630nm为参比波长, 测定其吸光度A0;在测定波长（如490nm/450nm）下测定样本的吸光度A,双波长测定后,取二者的差值, 测定结果的标准偏差比单波长下测定的要小,实验误差小。

在ELISA测定所使用的底物如邻苯二胺或四甲基联苯胺，显色终止后，在 630nm处的吸光度值都只有吸收峰处（490nm/450nm）吸光度值的1%以下，因此，利用双波长检测，不会影响检测灵敏度。

一般酶标仪比色应该首选双波长。

四、主要品牌

美国美谷分子

美国Thermo

奥地利Tecan

美国BioRad