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高效离子色谱柱研究

2019.12.13

离子色谱（IC）发展已经有四分一个世纪，作为一种独立的色谱分枝，并在许多领域得到广泛应用。
但离子色谱（IC）与其相似的色谱高效液相色谱（HPLC）相比，柱效要低很多（约为HPLC的1/3），而价格则要高很多（约HPLC的3到5倍）。
提高离子色谱的柱效，是离子色谱研究急需解决的问题，也将是推动离子色谱发展和应用的决定因素之一。
离子色谱柱效不高的原因
离子色谱采用抑制器（目前大部分离子色谱采用双柱型），抑制器产生死体积会使色谱峰扩散，这对弱保留离子特别明显。
离子色谱柱一般采用聚合物柱（如，国际上最好的离子色谱柱Dionex IonPac类)，与无机填料相比，聚合物柱刚性比较差，易收缩，因此同样的大小填料，聚合柱往往柱压比较高。
但硅胶型填料由于无法耐受强碱性淋洗液，使它在离子色谱柱应用受限制，虽然，曾有人尝试碳柱、锆柱、氧化铝柱，但实际效果并不理想。

涂覆型离子色谱柱
聚合物或者硅胶基反相填料，通过静态、动态涂覆表面活性剂、染料和乳胶，可制备成离子色谱柱（如季胺盐表面活性剂可以制备成阴离子色谱柱）。
涂覆型离子色谱柱的特点是简单、方便，价格便宜，也可以反复涂覆使用。
缺点是于色谱的柱容量不易控制（一般柱容量偏高），柱效也不高（一般报道在6400~10000理论塔板数/M），另外，还存在使用寿命问题。
但对新型色谱柱研制往往先从涂覆型开始然后再化学键合。
我们的工作
采用动态和静态涂覆阳离子（季胺盐类）表面活性剂等方式，对反相色谱柱和填料进行涂覆，制备阴离子色谱柱。
在涂覆过程中，添加非离子表面活性剂，从而控制阴离子色谱柱的柱交换容量，缩短被测物的保留时间。
控制涂覆过程，提高阴离子色谱柱的柱效。
对有关的机理进行研究，为一下研制高效离子色谱柱打下基础。
实   验
试剂
    乙腈采用Merck (Darmstadt,Germany)的HPLC级。其它淋洗液和被测物标准均为分析纯，购自Aldrich (Milwaukee, WI, U.S.A.)或Ajax (Auburn, N.S.W. Australia)。全部溶剂配制包括淋洗液和标准溶剂均采用Millipore Mill-Q纯水系统（Millipore,  Milford, MA, U.S.A.)的二次去离子水配制。
2、仪器
        离子色谱采用Dionex (Sunnyvale CA,U.S.A.) DX600型，配以GS50梯度泵，AS50柱温箱，AS50自动进样器, UI 20通过接口，和 Waters 484可变波长紫外检测器.  数据采用和处理采用Peaknet 6.2 软件。色谱柱分别采用Dionex IonPac NS1 (150 x 4 mm, ID) 聚合物柱，Dionex Acclaim 120 C18 (100 x 4.6 mm, ID), Waters (Milford, MA, USA) Nova-Pak C18 (150 x 3.9mm, ID), Phenomenex (Torrance, CA, USA) Synergi 4μ MAX-PR 80Å C12 (150 x 4.6 mm, ID), 和CERI (Chemicals Evaluation and Research Institute, Japan) L-column ODS (150×4.6mm,ID)，抑制器采用Dionex AMMS-UTRA 4mm自再生抑制器。

涂覆和分析过程
动态涂覆商品化反相柱采用，5mM 双十二烷基双甲基溴化(DD), 5 mM 十六烷基吡啶(CPC), 或5 mM 非离子表面活性剂(曲拉通 X100, 吐温20或Brij 35)以1 ml/min涂覆灭色谱柱1―2小时.也可能混合非离子和阳离子表面活性剂进行涂覆，如果有要求，可以串接紫外检测器在200nm下检测。
静态涂覆采用5μm的Dionex大孔聚合物填料，加入20mM DD和一定浓度非离子表面活性剂，超声后，用均浆法装柱。
DD涂覆柱采用5.0 mM 高氯酸钠以2.0 ml/min淋洗UV 200nm下检测，其它涂覆柱采用1 ml/min流速用 10 mM碳酸钠或2 mM高氯酸钠淋洗，抑制电导或紫外检测。
涂覆柱用淋洗液冲洗，平衡后进样分析测试。抑制采用循环方式，抑制电流为 50 mA 。
保留因子, k’,计算如下: k’=(tr-t0)/t0。这里t0, 是系统死时间，tr是被测物的保留时间。峰的不对称性(A)的计算如下=(RW5%+LW5%)/(2xLW5%), 这里RW5% and LW5% 分别是5%峰高时左边和右边的峰宽。理论塔板数用半峰宽方法计算。
结果与讨论所用非离子和阳离子表面活性剂
混合阳离子和非离子表面活性剂涂覆反相柱
与常规的涂覆方法不同，采用非离子表面活性剂与阳离子表面活性剂，可以有效控制阴离子色谱柱的交换容量。
动态涂覆商品化反相柱（包括聚合物和硅胶柱）和静态涂覆填料，得到结果是相似的。
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下图单纯涂阳离子表面活性剂与混合非离子表面活性剂涂覆的比较。
单纯涂阳离子表面活性剂的色谱柱
Conditions: column: L-column ODS coated with 5 mM  DD; eluent: 5 mM NaClO4 ;  flow rate, 2.0 ml/ min; detection, UV at 200 nm; sample: 100L Peaks:
1. 30 g/ml 醋酸,
2.  2 g/ml 亚硝酸,
3.  2 g/ml 溴,
4. 2 g/ml 硝酸
5. 2 g/ml 4-羟基苯甲酸，
6. 30 g/ml 草酸,
7. 30 g/ml 钼酸根,
8. 10 g/ml 苯甲酸,
9. 10 g/ml 邻苯二甲酸,
10. 30 g/ml 硫氰根
混合涂非离子和阳离子表面活性剂的色谱柱
Same conditions as last Fig except the column was coated with a mixture of 5 mM DD and 2 mM Tween 20.  Peak:
醋酸,
亚硝酸,
溴,
硝酸,
草酸,
4-羟基苯甲酸,
钼酸,
碘,
邻苯二甲酸,
苯甲酸
硫氰酸根.
不同比较的非离子和阳离子表面活性剂涂覆柱测定离子保留时间比较
混合表面活性剂涂覆灭存在的问题
混合表面活性剂涂覆柱还存在如下问题：
非离子表面活性剂量在适度，否则会出现色谱柱疏水性过强，对强疏水性离子（如苯甲酸类），超过一定量的非离子表面活性剂再增加非离子表面活性剂，反而会增加保留时间。
虽然，加入了非离子表面降低了色谱柱交换容量，但色谱柱效并没有改变。
柱压会随着涂覆而大大增加。
多层涂覆的高效阴离子色谱柱
考虑到色谱柱涂层的可能情况，我们采用了双层涂覆的方式，即先涂非离子表面活性剂，然后再涂阳离子表面活性剂。或者次序相反。
通过双层涂覆，我们可以得到非常高效的阴离子色谱柱，其理论塔板数达到约80000/M，考虑到离子色谱柱抑制器扩散，其柱效与HPLC柱基本一致。
这种方式涂覆，不同的非离子表面活性剂均有效，但所试的表面活性剂中曲拉通X-100最有为效。
下面是几种柱涂覆后的色谱分离图。

Dionex Acclaim 120 C18 5 m 120 Å (4.6 x 100 mm, ID) 涂覆柱的常规阴离子分离
Conditions: column: Dionex Acclaim 120 C18 5 m 120 Å (4.6 x 100 mm, ID) coated first with 5 mM Triton X-100 and then 5 mM CPC; eluent: 10 mM Na2CO3; flow rate, 1.0 ml/min; detection, suppressed conductivity with suppressor operated at 50 mA in the recycle mode; sample: 50 µL
Peak:
1. 2 µg/ml 氟,
2. 10 µg/ml 甲酸,
3. 5µg 氯,
4. 5 µg/ml 亚硝酸,
5. 10 µg/ml 磷酸,
6. 5 µg/ml 溴,
7. 10 µg/ml 硫酸,
8. 20 µg/ml 草酸.
9. 5 µg/ml 硝酸,
10. 20 µg/ml 4-羟基苯甲酸

乙酸及氟代乙酸的分离
Conditions:  column:  Dionex Acclaim 120 C18 5 m 120 Å (4.6 x 100 mm, ID coated first with 5 mM Triton X-100 and then 5 mM CPC; eluent: 10 mM Na2CO3; flow rate, 1.0 ml/min; detection by suppressed conductivity with suppressor operated at 50 mA in the recycle mode; sample:  50 µL
Peak:
1. 10 µg/ml 乙酸,
2. 10 µg/ml一氯乙酸
3. 10 µg/ml二氯乙酸
4. 50 µg/ml三氯乙酸
Waters Nova-Pak C18  (150 x 3.9 mm)涂覆柱的常规阴离子分离
Conditions:  column:  Waters Nova-Pak C18  (150 x 3.9 mm, ID) coated first with 5 mM Triton X-100 with 30% ACN and then 5 mM CPC; eluent:  10 mM Na2CO3; flow rate, 1.0 ml/min; detection, suppressed conductivity operated at 50 mA in the recycle mode; sample: 50 µL
Peak:
1. 2 µg/ml 氟
2. 10 µg/ml 甲酸
3. 5 µg/ml 氯
4. 5 µg/ml 亚硝酸
5.10 µg/ml 磷酸
6. 5 µg/ml 溴
7.10 µg/ml 硫酸
8. 20 µg/ml 草酸
9. 5 µg/ml 硝酸
10. 20 µg/ml 4-羟基苯甲酸
Phenomenex Synergi 4 µm MAX-PR 80 Å (4.6 x 150 mm)涂覆柱的阴离子分离紫外检测
Conditions:  column:  Phenomenex Synergi 4 µm MAX-PR 80 Å (4.6 x 150 mm, ID) coated first with 5 mM Triton X-100 with 30% ACN and then 5 mM CPC; eluent:  2 mM NaClO4, flow rate, 1.0 ml/min; detection, UV detection at 210 nm; sample:  50 µL
Peak:
1.  30 µg/ml 乙酸,
2.  2 µg/ml 亚硝酸,
3.  2 µg/ml 溴,
4.  2 µg/ml 硝酸,
5.  30 µg/ml 草酸,
6.  10 µg/ml 碘
7.  2 µg/ml 4-羟基苯甲酸
8.  30 µg/ml 铬酸,
9.  30 µg/ml 硫氰酸.
10. 10 µg/ml 邻苯二甲酸,
11. 10 µg/ml 苯甲酸,

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各类离子色谱柱效的比较
重现性和使用寿命
与单层涂覆柱相比，双涂覆柱有更好的重现性，比较理想的使用寿命。
重现性: RSD of tR(n=13)<3%
使用寿命: >1 month for >12 h/day
已经应用于: 自来水、肥料、植物的阴离子测定
肥料样品中阴离子的测定
Conditions: column: Phenomenex Synergi 4 µm MAX-PR 80 Å (4.6 x 150 mm, ID) coated with at first 5 mM Triton X-100 with 30% ACN and then 5 mM CPCl; eluent: 5 mM Na2CO3 /X, flow rate, 1.0 ml/min; detection, suppressed conductivity with regenerate current of suppressor is 50 mA with recycle mode; sample: 50 µL.
植物样品中阴离子的测定
Conditions: column: Phenomenex Synergi 4 µm MAX-PR 80 Å (4.6 x 150 mm, ID) coated with at first 5 mM Triton X-100 with 30% ACN and then 5 mM CPCl; eluent: 5 mM Na2CO3/X, flow rate, 1.0 ml/min; detection, suppressed conductivity with regenerate current of suppressor is 50 mA with recycle mode; sample: 50 µL.
可能的机理
先涂阳离子表面活性剂，然后再涂非离子表面活性剂，得到的色谱柱基本没有离子交换容量，说明色谱涂层呈两层状态。
双层涂覆对聚合物柱并没有柱效提高，可能是聚合物柱疏水性太强，非离子表面活性剂层作用不大。
提高离子色谱柱效原因可以认为是表面涂上非离子表面活性剂，使阳离子表面活性剂层表面更均匀和更薄，加速了离子交换的平衡。
可能的涂覆示意图，详细的机理还有待进一步探讨。
仅涂覆阳离子表面活性剂示意图
先涂覆非离子表面活性剂
再涂覆阳离子表面活性剂
涂覆型色谱柱问题
涂覆型色谱柱使用寿命一般为几个月，但可以反复涂覆。
硅胶型反相柱，一般不耐强碱性淋洗液，对于阴离子分离，常规的碳酸钠和氢氧化钠淋洗液会使色谱柱寿命缩短。
柱压会随着涂覆而大大增加。
下一步工作
解决柱压高和使用寿命问题，采用化学键合。
解决硅胶型反相柱的耐碱性问题，采用新型的固定相和流动相。
对高效离子色谱柱的机理进一步探讨。

色谱柱离子

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周锦帆