某口服固体制剂有关物质方法开发
背景介绍
这是一个仿制药有关物质的方法开发案例,由于药典方法或文献方法无法满足自研产品的有关物质检测。本文通过以一个文献方法为基础,重新设置梯度&流动相pH开发方法的过程,阐述本方法开发的思路及遇到的问题。
文献中该品种有关物质检测方法:色谱柱:辛烷基键合硅胶色谱柱柱温:50℃流速:1.2mL/min梯度:
对于此方法分析初步评价:首先,有关物质方法采用三相进行梯度实验的比较少见,对于仪器有要求,二元泵仪器无法完成该检测,对泵的精准性要求也比较高;其次,使用该方法对自研产品进行有关物质检测时发现有部分杂质分离情况不好。故希望通过一个梯度与pH的正交试验,对该检测方法进行一个全面的考察,顺便研究耐用性。
实验设计和数学建模研究
流动相A:50mM KH2PO4溶液(调pH5.0、pH6.0、pH7.0)流动相B:甲醇-乙腈(2:1, v/v%)(ps:原方法甲醇-乙腈体积比变换范围为(1.5:1~3:1),故折中考虑选择2:1,如在该比例条件下没有好的结果,可能后期会进行甲醇-乙腈比例的考察)梯度与pH正交试验设计表,表1:
表1 梯度和pH的正交设计
表2 有关物质保留时间
通过ACD软件构建梯度&pH两因素模型,模型如图1:
图1 梯度和pH的模型图,提示pH5.6范围下有全局最优
表3 最优结果下的较短时间的梯度
图2 pH5.6下的验证实验结果
表4 模型实测预测表
图3 去除辅料峰影响后的有关物质模型图
表5 pH 6.0下执行的梯度
在该条件下得到图谱,图4:
图4 pH6.0下梯度表的实际数据图
各杂质分离良好,从模型上看,耐用性范围较宽,可作为最终检验方法进行预验证。
Waters UPLC再加上使用ACD软件的梯度&pH建模进行的方法优化,进行方法的设计和模型验证的情况下,前后进样在18针左右,耗时2个工作日(如果紧张点一天就完成实验),极大的提高的方法开发及方法优化的效率,而且在进行建模后能够对整个考察参数范围内各杂质RT运动轨迹及分离状况了然于胸,保证开发出的方法耐用性更稳健。问题讨论
目前已经有了可用的方法,倒回来再研究pH5.6下的模型预测和实测失真的问题,在首次进行建模后验证时发现的pH5.6下葡萄糖加和物与杂质IV预测不准的问题。将此案例与ACD中国区经理的阎作伟沟通,被评价为“非常有意思的结果”,因为出现了主成分和加合物杂质在pH5和pH7两次靠近的现象。阎作伟经理表示这种情况可能发生,但实际上还是很少见。他提醒是否在建模时杂质定错了位。遂与实验实施人员复盘了所有数据,结果发现,杂质定位判断的确出错了,如图6a和图6b
图6a 错误的杂质定位判断
图6b 正确的杂质定位判断
图7 三个杂质的LogD叠加曲线
图8 定位修正后的模型能够准确预测出pH5.6的共流出
写在最后的话
有位中国科学家说过“科学是严谨的,是容不得半点马虎的。”一个小小的判断错误导致进入了错误的空间,导致模型部分失效。此次是在错误的模型上,得到的一个好的结果,有赖于pH6.0 下的三个较好的分离结果。但找到好结果是源于好运气,假设pH6.0下并没有良好的分离的话,这个方向感就很难把握了。判断不明就需要增加实验的数量,把空间研究的更加透彻。
感谢天地恒一的案例,给读者带来了一个重要的提示。Peak Matching 一直是进行保留时间数学建模的难点之一。不论用自动化还是用手动Peak Matching都可以借助DAD,MS的结果做辅助。如果只是单波长下用色谱峰的形态进行Peak Matching,的确很考验眼力,如果是混标情况下,最好把加标的浓度配的不一样,这样也有利于提高辨识度。
by 阎作伟
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