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某双羧酸化合物的双峰消除研究案例

ACDLabs CN

2021.6.25

Abstract
摘要

在进行有关物质分析方法开发过程中，经常会遇到酸性化合物在酸性条件下出现双峰的问题。尤其是具有双羧酸结构的化合物，例如丁二酸，会出现双峰。通常这些双峰被证明是稀释剂的溶剂效应。猜测是由于一部分双羧基化合物被溶剂包裹，另外一部分游离，被包裹的部分不能在色谱柱内迅速释放导致，并且通常情况下这类化合物的保留时间较差。本实验也发现了类似的双羧酸双峰情况，但与常见的溶剂效应相比存在一些差异。我们对此进行了研究。

Background
背景信息
01化合物结构信息和性质分析

图1.产物以及有关杂质logD图（ACD/AutoChrom绘制）

通过LogD图可以确定相关化合物极性较大，在反向色谱体系中，保留能力不强。低pH时各组分呈分子态，疏水性高于高pH时的疏水性，会有一定的保留；在pH4至6之间，属于相关物质疏水性变动区；到了高pH值范围，酸性基团都电离化，各组分呈离子态，分子极性增加，疏水性较低，几乎无保留能力。基于对物质logD曲线的分析，选用以下色谱条件。

02色谱条件

表1.色谱条件

由于化合物极性大，本次采用WatersXselect HSST3柱，T3顾名思义即指三键键合的C18（如下图），该色谱柱采用聚合物杂化颗粒，高强度硅胶技术及低密度封端技术，可显著增强极性分子的反相保留能力，且能与纯水相兼容。

图2.Waters T3 色谱柱的硅胶颗粒内部结构示意图

得如下图谱：

图3.样品加混合杂质溶液出现双峰现象

该条件下，混合杂质溶液中杂质为单峰，样品杂质混合溶液中AMCA-2及AMCA-4ACID均为双峰。为了对导致此现象的原因进行研究，设计了以下多组实验进行探究。

实验设计1：改变稀释剂盐酸的量

将稀释液中盐酸浓度升高，依次使用0.2%，0.5%，1.0%的盐酸作为稀释剂，获得典型图谱如下：

图4.不同浓度的盐酸对消除双峰的影响

混合溶液在不同浓度盐酸条件下，AMCA-4ACID与AMCA-2会有不同的双峰情况。从图中可以看出，随着稀释剂中盐酸的浓度增大，以上两种物质的双峰情况得到消除。

实验设计2：更换酸的种类

将稀释剂由1.0%盐酸换成1.0%甲酸，图谱如下：

图5.甲酸替换盐酸后的双峰消除情况

Comments：本实验设计的初衷是预测在相同浓度的甲酸下(1.0%甲酸pH=2.1；1.0%盐酸pH=0.53)，由于甲酸是弱酸对于改善AMCA-2溶剂效应没有盐酸效果好。但实验结果与我们预想背道而驰。

实验设计3：改变进样量

以0.2%盐酸和0.5%盐酸为稀释液，分别进样10ul、5ul、2ul，图谱如下：

图6.不同稀释剂及不同进样量下双峰情况

改变进样量保留时间无改变，在两种不同稀释剂浓度下，只有进样量当进样量由10µl降低到2µl时才为单峰，其他进样量下都为双峰。溶剂效应一般只影响较早的色谱峰，但本例的第二个色谱峰有双峰现象，而第一个峰不受影响。这一现象充分说明了双羧酸类物质的特殊性。

实验设计4：加入强电解质氯化钠以及使用高比例的乙腈为稀释剂

用不同稀释液分别配制1mg/mL（AMCA-6E+AMCA-2+AMCA-4ACID）溶液，进样分析。

图7.强电解质对双峰的影响以及高比例乙腈对双峰的影响

不同稀释液结果汇总表：

表2.强电解质和高比例乙腈对双峰的影响

由上表可知当向A相里加入强电解质来增加流动相的混乱度，利用熵增效果来对抗溶剂效应也是有效的。而高比例的乙腈令两个物质都显示为双峰，明显存在溶剂效应。

实验设计5：变化样品含量

不同浓度的样品+相同量的杂质，进样量均为20ul、稀释液均为0.2%盐酸。图谱如下：

图8.保持杂质加入含量不变，降低样品的含量

从上图中可以看出，随着样品浓度的降低AMCA-4ACID和AMCA-2双峰得到了消除。似乎是样品基质导致了AMCA-4ACID和AMCA-2的双峰，考虑到API是以钡盐形式存在，而钡离子易于与羧酸形成络合效应，便猜想可能是API中的钡离子导致了AMCA-4ACID和AMCA-2溶剂效应，于是设计了以下实验进行研究。

实验设计6：用无钡样品进行研究

将样品中的钡去除掉，制作不带钡离子混合溶液，样品不带钡离子本身pH在2~3之间，图谱如下：

图9.无钡样品在低浓度盐酸下的峰型情况

由上图可知将样品基质中的钡离子除去后的AMCA-4ACID和AMCA-2均为单峰。

Conclusion
总结和结论

本例中观察到最严重的双峰的化合物是含有双羧酸的化合物AMCA-2。随着进样量由10uL降到2uL时，双峰才会消失，这与一般的由稀释剂导致的溶剂效应稍微降低进样量双峰即有明显改善的现象有所不同，因此显得较为特殊。当稀释剂中盐酸的量增加到1.0%时AMCA-2的双峰也得到了消除；换用同等浓度的甲酸，AMCA-2的双峰也会消失，显示出酸液浓度对消除双峰的正面影响。在稀释剂中加入强电解质氯化钠增加流动相的混乱度，也有利于消除溶剂效应。最终，通过除去样品中钡盐的浓度，消除样品带来的基质效应，解决了AMCA-2和AMCA-4ACID的双峰问题。

本例中的AMCA-2和AMCA-4ACID相比，虽然AMCA-2出峰更迟但体现出更强的溶剂效应，充分说明了双羧酸类物质的特殊性。具体到本例的情况，由于样品基质中的钡盐影响，带来了很有趣的实验现象。

Thanks
致谢

本实验受到ACD/Labs技术群的各位人士的帮助和指导，在此一并表示感谢！

我们在ACDLabs微信公众号上发表过一篇关于丁二酸的双峰到溶剂效应消除（点击文章名字阅读原文）的讨论文章，大家对导致原因及解决办法纷纷提出自己的见解。ACD/AutoChrom产品的核心用户江西同和药业在进行有关物质分析方法开发时，同样遇到了羧酸类化合物双峰问题,其中双羧酸类物质相比单羧酸物质体现出更强溶剂效应。用户尝试了不同的解决方法，并最终确认了导致溶剂效应的原因。感谢江西同和药业对案例的分享！

——ACD/Labs 李丹