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有关保留时间

基泰生物
2022.3.24
add76c09caf38f5c502354bc1bff9f79.png春分 | 天地和同，草木繁动d347cd5f2cfc15b542cc84fc7a8b07ed.gif保留时间d347cd5f2cfc15b542cc84fc7a8b07ed.gif保留时间异常漂移的几种最常见的原因

  • 色谱柱平衡

首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。通常平衡需要10-20个柱体积的流动相，但如果在流动相中加入少量添加剂（如离子对试剂）则需要相当长的时间来平衡色谱柱。


如果你在使用未修饰的硅胶柱做正相色谱，那么这是最可能发生的问题。正相色谱的保留时间容易受到硅胶表面吸附的水含量的影响，然后是溶解在流动相中的水的作用。因为水在正己烷或二氯甲烷等试剂中的溶解度非常低，所以色谱柱平衡需要很长时间。通常解决硅胶和水的平衡问题的办法就是使用与水“半饱和”的试剂。制备方法是把1体积的疏水试剂用水饱和后，再与相同体积的“干燥”试剂混合。这个方法可以极大的加快平衡时间。


  • 流路系统异常

流路系统的异常分为两种情况，保留时间的漂移有可能是流路系统有漏泄导致的，需要检查流路系统的各连接部件以及泵的密封是否正常。除此之外，还有流动泵头发生的气阻，导致保留时间随机的漂移，往往要么是保留时间延迟，要么是保留时间提前。为了防止泵头的气阻发生，对流动相的脱气是非常必要的。


  • 流动相组成或污染

流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动相等。如果你没有使用仪器的在线混合装置，那么流动相的组分可能在缓慢的蒸发。当你用氦气流喷射流动相的方法赶气泡的时候，你必须控制喷射的速率最小。 


流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上，从而造成保留时间的漂移。应注意：水是很容易污染的流动相成分。


在极个别的情况下，如果样品溶液与流动相不相容，也有可能会导致保留时间的漂移，很好理解，样品在进样的时候，并没有达到溶解平衡的状态，自然会导致峰型的异常（比如峰的分裂）以及保留时间的不一致。


  • 固定相稳定性

固定相的稳定性都是有限的，即使在推荐的PH范围内使用，固定相也会慢慢水解。要保持固定相的水解稳定性，最好是在中性PH值，低温下PH3-5左右，等度条件好于梯度条件。当等度条件下发生水解时，键合相通常会自我吸附，达成一种区域平衡。然而，在使用高浓度的有机溶剂时，例如在梯度洗脱或者冲洗色谱柱的过程中，这种平衡被打破，键合相会被冲洗出色谱柱。水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定；长链键合相比短链键合相稳定；烷基键合相比氰基键合相稳定的多。

经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解，如氨基键合相等。


  • 色谱柱污染

污染源可以是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器密封垫，以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。

样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分，就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质。如：配药中的赋形剂，生化样品（如血清）中的蛋白及类脂类化合物，食品样品中的淀粉，环境水样中的腐殖酸等。通常样品中的强保留组分具有较高的分子量，在此情况下，保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加。可以通过使用固相提取（SPE）等样品前处理方法来去除样品基质的影响。

避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。相比之下，找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。通常使用在给定色谱条件下的强溶剂，但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。如THF可去除反相色谱柱中的许多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解。DMSO常常用于去除反相色谱柱中的蛋白。使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。


  • 疏水坍塌

当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时，有时会发生分离突然丧失及被分析物质保留明显降低或完全不保留的现象，这就是疏水坍塌。此现象是由流动相不浸润固定相表面而致。挽救的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相，再用高水含量的流动相进行平衡。由是色谱柱长期储存也会发生此现象。使用内嵌极性基团的反相色谱柱或非端基封口的色谱柱也可避免发生坍塌。


  • 样品成分的诱导作用

如果样品中含有大共轭体系化合物，可以形成较强的π-π键，在较大的化合物比例下，量较少的成分被量大的成分所诱导，削弱了化合物于色谱柱之间的作用力，从而减弱了色谱柱的筛选作用导致保留时间漂移。


  • 温度变化

如果你的样品是自动分析过夜或者过了周末的，那么你得到的保留时间漂移的结果可能和实验室温度变化有关。在许多地方，室温的设置在晚上或者周末通常是不一样的。通常来讲，1℃的变化导致保留时间漂移大约1%到2%


保留时间不重现有两种不同的情况：即保留时间漂移和保留时间波动。前者是指保留时间仅沿单方向发生变化，而后者指保留时间无固定规律的波动。将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。如保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化，如固定相流失（例如通过水解），色谱柱污染（由样品或流动相所致）等，而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。

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