初学者的福音—GC/MS代谢组学Q&A

麦特绘谱

2018.6.15

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GC/MS是代谢组学三大分析平台之一，因其高灵敏度、高稳定性和公共数据库定性方便等优点，成为广大科研工作者重点选择的检测平台。那么，在实际使用中我们会碰到哪些问题？针对这些问题，我们该如何解决？小编精心挑选了一些常被问到的经典问题，并给出了详细的回答。希望对您有所帮助。

1.GC/MS平台有哪些？

目前，市面上和GC串联的质谱有多种，如TOF、Quadrupole、Linear Ion Trap、Orbitrap、Sector MS以及串接质谱如Q-TOF，TQ等等。目前在代谢组学领域应用最广泛的还是GC-TOFMS平台，因为它具有高通量、高灵敏和稳定性好等优势。对于靶向定量代谢组学，则可选择GC-TQMS。

2.GC/MS分析生物样本为何要衍生化处理？有哪些衍生化的方法？

GC的流动相为气体（通常为高纯氦），这就要求被分析物必须能够气化，而生物样本中很多内源性代谢物都含有极性基团，具有沸点高、不易气化特点。衍生化能够降低这些代谢物的沸点，增加它们的热稳定性，以便分析能够顺利进行。衍生化方法及试剂种类繁多，根据不同的分析目标，需选择合适的衍生化方法。如分析脂肪酸，我们可以采用甲酯化衍生。在GC/MS代谢平台上，最常用的衍生化方法是硅烷化衍生，因为它的广谱高效。在进行硅烷化衍生之前，还需添加甲氧胺吡啶溶液，以封闭羰基（针对α-酮酸和糖类，保护作用），减少衍生化副产物的生成。

3.GC/MS能检测到哪些类别的代谢物？

衍生化极大地拓展了GC/MS的检测分析范围。GC/MS能检测到有机酸、氨基酸、单糖、糖醇、胺类、脂肪酸、吲哚、单甘油酯、核苷、二糖、生育酚、甾醇和胆汁酸等代谢物。

4.保留指数是什么？其目的是什么？

保留指数（Retention Index）又称科瓦茨（kovats）指数，是重要的定性指标。它需要采用一系列保留指数基准物质（如脂肪酸甲酯和正构烷烃）作为参考，将保留时间转换为指数。相比于保留时间，保留指数的特点是它只和色谱柱类型有关，而和其他仪器参数无关。例如，针对不同的生物样品，我们可能需要不同的升温程序，以达到最佳的色谱分离。此时，代谢物的保留时间就会发生改变，无法和质谱库中的标准时间进行匹配。再比如，色谱柱使用较长时间后，柱前端容易被严重污染，从而影响柱效。我们一般会将柱前端截断30-50公分（更好的方法是色谱柱前添加保护芯片）以恢复柱效。此时，所有代谢物的保留时间都会提前。保留指数不会受到这些实验条件的影响，依然可以用于准确定性。

5.GC/MS如何提高定性准确度？

GC/MS的定性有双重标准，一是上文提到的保留指数，二是质谱信息的相似度（similarity）。不同于LC/MS的软电离源，GC/MS使用的EI源属于硬电离，能量较强且稳定，在将代谢物分子电离后，分子离子峰进一步碎裂产生丰富的碎片离子。因此，我们很难在GC/MS上看到分子离子峰。GC/MS提供的是代谢物的“指纹图谱”，将仪器得到的实际指纹图谱和质谱库（如NIST库）进行比对后，我们将会得到一个叫相似度的指标。保留指数和相似度都必须满足设定的阈值，软件才会给出色谱峰的定性结果。最后采用标准品质谱信息进行完全比对定性，也就是说只有经过标准品比对，代谢物才是被百分之百定性。

6.什么是解卷积？

我们平常看到的总离子流色谱图（TIC）其实是软件根据质谱采集到的一个个数据点拟合出来的。每一个数据点背后就有一张质谱图。当两个或多个色谱峰没有分离开而共流出时，质谱采集到的数据点就是一张混杂的质谱图，包含了多个组分的碎片信息。如果直接用于定性分析会导致物质相似度的降低和组分的丢失。解卷积（Deconvolution）就是利用数学算法将色谱未分离的组分重新解析开，还原它们最真实的质谱信息。需要指出的是，解卷积不是万能的，好的色谱分离依然十分重要。

7.代谢物的峰面积是如何计算的？

软件会对原始质谱数据做基线计算、平滑、峰查找和解卷积。在解卷积之后，软件会考察代谢物所有碎片的信噪比、碎片提取离子流图（EIC）的对称性以及碎片色谱峰的纯度（共流出干扰的程度），最终自动挑选出一个最优的定量离子（Quant Mass）。最终的峰面积是对定量离子进行积分所得。

8.为什么有的代谢物会出不止一个峰？

怎么处理？

这主要是由于衍生化反应造成的。当代谢物有多个活泼氢时，会产生三甲基硅烷基（TMS）取代数目不同的衍生产物。如甘氨酸会生成2TMS和3TMS取代的衍生物。即使衍生试剂过量，也很难保证不同TMS取代个数的产物比例会保持一致。因此，通常的做法是将同一个代谢物的所有衍生产物的面积进行加和。我公司自主开发的XploreMET软件会自动完成这一步骤。

9.GC/MS平台数据处理软件有哪些？

在进行统计分析之前，我们需要将仪器采集的质谱数据转换为分析软件可读的数据矩阵。这其中涉及的数据处理包括基线矫正、去噪、平滑、解卷积、积分、定性、保留时间矫正和峰匹配（peak alignment）过程，最终输出一张包含样本、代谢物、保留时间和峰面积等信息的表格。商用处理软件有我公司的XploreMET、LECO公司的ChromaTOF和Spectral Works公司的 AnalyzerPro。免费的软件有Scripps研究所的XCMS、开源的MZmine 2和日本理化研究所Hiroshi Tsugawa博士主开发的MS-Dial。在使用之前，你需要将原始质谱数据转换为通用的数据格式如netCDF和mzML，或软件要求的其他格式。