分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

固相合成法制备抗原肽环肽

2020.6.08

1.1 仪器与试剂

多肽合成仪(CS536，美国CSBio公司)，半制备型高效液相色谱仪(Waters Delta Prep4000，美国Waters公司)，分析型高效液相色谱仪(Agilent 1100，美国Agilent公司)，冷冻干燥机(Christ Alpha，德国Christ公司)，激光解吸电离飞行时间质谱仪(LCQ Deca，美国ThermoFinnigan公司)，紫外分光光度计(Beckman DU7400，美国Beckman公司)，C18反相分析柱(Sepax GPC18，5μm，120，4.6mm×150mm)。

实验所用FmocProMerrifield Resin(取代值0.291mmol/g，交联度1%，100～200目)、BocValWang Resin(取代值0.523mmol/g，交联度1%，100～200目)、FmocProCTC Resin(取代值0.42mmol/g，交联度1%，100～200目)、BocTyr(tBu)OH、BocProOH、BocIleOH、BocLeuOH、FmocTyr(tBu)OH、FmocProOH、FmocIleOH、FmocLeuOH、Bocstatine(3s，4s)OH、HATU［O(7偶氮苯并三氮唑1氧)N，N，N′，N′四甲基脲六氟磷酸酯］、HBTU(苯并三唑1四甲基六氟磷酸酯)、HOBt(N羟基苯并三唑)、BOP(邻苯二甲酰丁辛酯)、DIEA(N，N二异丙基乙胺;二异丙基乙胺)、TFA(三氟乙酸)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO(二甲亚砜)、DCM(二氯甲烷)、ACN(乙腈)、EDC［1乙基3(3二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐］、NMM(N甲基吗啉)和苯甲硫醚均由杭州中肽生化有限公司提供，哌啶经重蒸后使用，水为二次去离子水。

1.2 HS1及其类似物的化学合成

本文所合成的5种环肽序列分别为：
    HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6Pro7
    Leu8)；
    A1HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3Pro4Tyr5Val6
    Pro7Leu8)；
    A2HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3statine4Tyr5Val6
    Pro7Leu8)；
    A3HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6
    statine7Leu8)；
    A4HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3statine4Tyr5
    Val6Pro7Leu8)。

虽然这5种抗原肽环肽或环肽类似物的序列如上面所表示的非常相似，并且按照顺序给每个氨基酸残基做了编号，但考虑到每个化合物的疏水性和空间位阻可能并不完全相同，加之合成的线性肽链终究要环化成抗原肽环肽，因此，为了方便、有效地合成目的产物，我们选择接肽反应的第一个氨基酸也不尽相同。

(1)HS1的合成路线与纯化

树脂溶胀调用自编程序Method1，树脂溶胀的具体方法是将FmocProCTC Resin 4.76g(合成规模为2.0mmol)用200ml DMF浸泡30min，使之充分溶胀，然后抽干。

脱除氨基保护基调用自编程序Method2，具体方法为加入含20%哌啶的DMF溶液20ml，搅拌反应30min，再抽干。然后用DMF洗涤5次，以除去残留的脱保护试剂。手工取样，茚三酮检测，若树脂呈深蓝色，则表明Fmoc保护基已经脱除。

接肽反应调用自编程序Method3，具体方法是在反应器中加入溶解有3.33g FmocValOH的200ml DMF溶液，机械搅拌2min，然后加入HBTU 3.57g，最后加入NMM 2.02g［AA∶HBTU∶NMM(mol/mol)=3∶2.85∶6］，反应30min。抽干，用DMF洗涤3次，然后用甲醇洗涤树脂，以除去氨基酸溶液和DMF，以便手工进行茚三酮检测，检测结果若树脂呈现无色，则说明反应比较完全。依次调用程序Method2和Method3，按肽链的氨基酸序列依次用FmocTyr(2BrZ)OH、FmocProOH、FmocProOH等重复以上接肽反应，直至最终合成出所需肽链。合成顺序为：Pro，Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，L序为：Pro，Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ileeu。
后续类似物的合成中，表1所列参数基本不变。BocstatineOH的投料比为2，接肽反应时间为40min，脱保护基时间为30min。

肽链的切割将合成肽链用切割液［TFA∶TIS(triisopropylsilane)∶H2O=95.0∶2.5∶2.5］在低于20℃的条件下切割，反应时间为2.5h，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，4000表1 HS1合成中各氨基酸投料比、接肽反应时间r/min离心3min，真空干燥12h，得线性肽链的粗品约1.5g。

抗原肽肽链的环化将线性多肽粗品1.4g用200ml DMF溶解，依次加入EDC(2eq，0.6g)、BOP(1eq，0.7g)、HOBt(2eq，0.42g)和DIEA(5eq，1.1g)，过夜环化。加入EDC可以加速缩合反应。蒸干DMF，得环肽粗品1.35g，粗品用MALDITOF质谱仪进行分析鉴定。

环肽粗品的纯化将上述环化粗品肽溶于适量DMSO中(由于此肽的水溶性不好，上样浓度要严格控制在小于1mg/ml)，上样样品用5μm的滤纸过滤。制备色谱柱为Waters XBridge C18、5μm反相柱；洗脱液：A液为0.1% TFA的水溶液，B液为含0.1% TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm。采用60min内B液由30%～65%的线性梯度洗脱方式，流速为38ml/min。收集纯度高于95%的馏分。最后冷冻干燥，得100mg纯度大于90%的最终产品。

分析型HPLC检测纯度色谱柱为SepaxGPC18反相柱(4.6mm×150mm，5μm，120)；洗脱液：A液为0.1% TFA的水溶液，B液为含0.1% TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm。采用20min内B液由60%～80%的线性梯度洗脱方式，流速为1.0ml/min。

MS鉴定激光解吸电离飞行时间质谱仪检测目标产物的分子量。

(2)A1HS1的合成路线与纯化与HS1的合成略有不同，在A1HS1的合成中，合成方法主要有以下几点变化：①树脂改为FmocProMerrifield Resin；②氨基酸为Boc保护；③每连接一个氨基酸残基，要用50% TFA/DCM将肽链切割下来，然后脱保护、洗涤、活化树脂，再连下一个氨基酸残基，最后从树脂上将肽链切割下来的切割液为HF，时间1.2h；④纯化时梯度洗脱条件为B液：70%～100%；⑤HPLC分析时B液：61%～81%；⑥合成顺序为：Pro，Val，Tyr，Pro，statine，Ile，Ile，Leu。其余同HS1合成。冷冻干燥后得250mg纯度大于93%的最终产品。由于溶解度比HS1好，故收率较高。

(3)A2HS1的合成路线与纯化类似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比较，在A2HS1合成中：①树脂为FmocProCTC Resin；②氨基酸为Fmoc保护；③最后切割液为F液，时间2.5h；④纯化时梯度洗脱条件为B液：65%～90%；⑤HPLC分析时B液：60%～80%；⑥合成顺序为：Pro，Ile，Ile，Leu，Pro，Val，Tyr，statine；⑦因statine是用Boc保护，因此在连接statine后，要将肽链片段先从树脂上切割下来，然后脱保护、洗涤、树脂活化，再连下一个残基。其余同HS1合成。冷冻干燥后得268mg纯度大于92%的最终产品。由于溶解度比HS1好，故收率较高。

(4)A3HS1的合成路线与纯化类似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比较，在A3HS1合成中：①树脂为FmocValWang Resin；②氨基酸为Fmoc保护；③切割液为F液，时间2.5h；④纯化时梯度洗脱条件为B液：43%～85%；⑤HPLC分析时B液：50%～70%；⑥合成顺序为：Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，Leu，statine；⑦因statine是用Boc保护，因此在连接statine后，要将肽链片段先从树脂上切割下来，然后脱保护、洗涤、树脂活化，再连下一个残基。其余同HS1合成。冷冻干燥后得245mg纯度大于98%的最终产品。由于溶解度比HS1好，故收率较高。

(5)A4HS1的合成路线与纯化类似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比较，在A4HS1合成中：①树脂为FmocProMerrifield Resin；②氨基酸为Boc保护；③每连接一个氨基酸残基，要用50% TFA/DCM切割，然后洗涤，再连下一个氨基酸残基，最后从树脂上将肽链切割下来，切割液为HF，时间1.2h；④纯化时梯度洗脱条件为B液：62%～80%；⑤HPLC分析时B液：62%～82%；⑥合成顺序为：Pro，Val，Tyr，statine，statine，Ile，Ile，Leu；⑦因statine是用Boc保护，因此在连接statine后，要将肽链片段先从树脂上切割下来，然后脱保护、洗涤、树脂活化，再连下一个残基。其余同HS1合成。冷冻干燥后得215mg纯度大于90%的最终产品。由于溶解度比HS1好，故收率较高。

固相合成法

互联网

喜欢作者我要约稿

喜欢作者

打赏方式

固相合成法制备抗原肽环肽

周锦帆