随机引物合成法双链DNA探针标记法
随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'→3'外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。
材料：待标记的DNA片段。
设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
试剂：
(1)随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。
(2)10×随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。
(3)Klenow片段。
(4)20mmol/L DTT。
(5)未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。
(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(7)缓冲液A：50mmol/L Tris·Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5% SDS。
操作步骤:
(1) 200ng双链DNA(1μl)和7.5ng随机引物(1μl)混合后置于eppendorf管内,水浴煮沸5分钟后，立即置于冰浴中1分钟。
(2) 与此同时,尽快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管内混合下列化合物:
20mmol/L DTT 1μl
未标记的dNTP溶液 1μl
10×随机标记缓冲液 1μl
[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl
ddH2O 1μl
(3) 将步骤(1)eppendorf管中的溶液移到步骤(2)管中。
(4) 加入5单位(约1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒, 使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。
(5) 在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。同时计算放射比活性。
[注意]1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。
2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。
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