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BioXp™3200基因打印机系统在抗击COVID-19新冠的运用

2021.3.01

鉴于COVID-2019造成的全球医疗紧急情况，加快创新步伐和开发工具来应对COVID-19的传播至关重要。科学界正在发挥其最大的创造力，以识别和推进预防，检测和治疗的解决方案。BioXp™3200系统是使全球研究人员能够快速合成SARS-CoV-2基因组部分的理想平台，使它们易于用于开发疫苗，诊断和治疗方法。

介绍

SARS-CoV-2是传染病COVID-19的致病因子，COVID-19已经被认为是全球大流行疾病。SARS-CoV-2感染了成千上万的人，夺走了全世界成千上万人的生命^[1]。SARS-CoV-2也与2002-2003年导致SARS大流行的病毒密切相关，共有约80％的基因组的相似性^[2]。该病毒的主要传播途径是通过感染者产生的呼吸道飞沫传播。密切接触（<〜6英尺）会增加人与人之间传播的机会（导致在社区内可以迅速传播），从而使该病毒具有高度传染性。预期世界卫生组织（WHO）已宣布COVID-2019爆发为全球性公共卫生突发事件，并将其确认为全球大流行^[3]。

SARS-CoV-2，类似于SARS和MERS爆发的致病因子，是长度约为30kb的单链正链RNA基因组，是RNA病毒中最多的病毒之一。冠状病毒是一类由外套膜包裹的正链ＲNA 病毒，具有螺旋对称的衣壳和外套膜结构。冠状病毒基因组为线性单股正链ＲNA，5' 端为甲基化的帽状结构，3' 端具有 poly( A) 尾巴，长度在 27 ～ 32 kb之间，是目前已知的ＲNA 病毒中最长的ＲNA 链^[4-5]。SARS-CoV-2 的RNA基因组( 如图 1 所示) 全长在 26000～32000 个碱基之间，Roujian Lu 等人根据从病人样本分离得到的 6 组病毒基因组分析预测SARS-CoV-2至少有 12 个编码区，包括非结构蛋白开放阅读框( open reading frame，OＲF) 1ab、3、7、8、9、10b、13、14 和 4 个结构蛋白刺突( S) 蛋白、膜( M) 蛋白、包膜( E) 蛋白、核衣壳( N) 蛋白^[6]。

SARS-CoV-2冠状病毒颗粒 (如图2所示) 是由一个正链的ＲNA 基因组和 4 个结构蛋白 S、E、M 和 N 组成。磷酸化 N 蛋白组成病毒核衣壳，该蛋白被埋在磷脂双层中,并被S覆盖。M蛋白和E蛋白位于病毒包膜的S蛋白之间，构成了病毒体。

根据基因序列分析，SARS-CoV-2在遗传学上与 SARS-CoV 和MERS-CoV的同源性分别为 79%和 50% ^[6]。对比SARS-CoV 和MERS-CoV 序列，SARS-CoV-2 在非结构蛋白区域 ORF3、ORF6、7 和 8，以及结构蛋白E、N，特别是 S 蛋白的差异^[7]，导致SARS-CoV-2在病毒靶向宿主和免疫反应能力上的改变，进而影响了SARS-CoV-2的毒力和传播能力，提示对于 COVID-19临床用药、疫苗开发以及疾病防控策略，应在两种冠状病毒病的基础上进行调整^[8]。

到目前为止，尚无疫苗或治疗药物可抗击SARS-CoV-2。生物学，特别是DNA书写技术，可以快速研发预防剂（疫苗）和治疗剂（单克隆抗体）。此外，DNA书写可以生成用于诊断试剂盒和测定开发的质量有保证的材料。

经过合理重新设计的全长减毒基因组有助于开发针对该病毒的疫苗。另外，病毒基因组部分有助于产生抗原的抗病毒抗体，从而可以开发出可以有效治疗感染患者的治疗方案选择。研发疫苗，诊断剂和治疗剂的开发对于阻止这种感染的传播是必不可少的。

在本应用笔记中，我们描述了SARS-CoV-2整个基因组的按需生产。基因组部分是使用BioXp™3200系统设计合成的。我们还描述了这些部分的连接以装配SARS-CoV-2的全长基因组作为大肠杆菌中的细菌性人工染色体（BAC）。鉴于到目前为止已经确定了SARS-CoV-2的基因组变异体的数量（https://nextstrain.org/ncov），可能有必要将其迅速纳入疫苗，治疗和诊断开发流程。3200系统通过在仪器的单个通宵运行中快速合成多达32个独立的变异基因组部分，从而加速了这一流程。

方案

在BioXp™3200系统上设计和合成SARS-CoV-2基因组部分Codex的专有设计软件使用重复，GC流量，GC含量等参数计算序列复杂性，并合理设计了SARS-CoV-2基因组的分阶段构建（约30kb）。该工具能够手动添加添加独特的GibsonAssembly^®限制性核酸内切酶位点之后的序列（30bp）。在组装的所有三个阶段中这些特征允SARS-CoV-2基因组片段的扩增和克隆（图3）。设计完成后，我们下了订单，在三个工作日内收到了寡核苷酸板和专有试剂。

图3：SARS-CoV-2基因组的分层装配方案。

使用三个组装阶段合成基因组：在BioXp™3200系统上完成24 X〜1.4 kb的第一阶段组装，然后将6 X〜5.3 kb组装成第二阶段分子和〜30 kb第三阶段基因组。

我们将寡核苷酸板和试剂加载到BioXp™3200系统上，并启动了自动生成的程序。BioXp™运行始于每个片段的初始构建，然后进行错误校正，I级分子的扩增和DNA片段的纯化。BioXp™3200系统成功生成了构成整个SARS-CoV-2基因组的所有24个片段（图4）。

图4：使用BioXp™3200系统组装SARS-CoV-2基因组。

（A）在BioXp™系统上合成的24Xstage I分子然后组装成Stage II和Stage III分子。

（B）使用限制性核酸内切酶处理从BAC释放〜30kb SARS-CoV-2基因组后，使用FIGE分析分析携带III期分子的克隆。

（C）沿着侧分子量标准克隆到BAC中的完整基因组的超螺旋DNA分析（显示了来自单个代表性克隆的DNA分析）。

全长SARS-CoV-2基因组的层次组装

使用GibsonAssembly^®HiFi套件（Codex目录 no. GA1100），我们克隆了第I阶段的分子（〜1.4 kb），并使用Sanger测序（GENEWIZ）对其进行了测序。我们使用GibsonAssembly^®HiFi试剂盒将三个连续的，将第I阶段分子组装成第二II阶段分子，并通过PCR扩增了产物，然后按尺寸选择产品。使用GibsonAssembly®Ultrakit（Codex no.GA1200）将这些II阶段分子进一步组装成SARS-CoV-2的全长基因组，并使用BAC进行克隆。通过菌落PCR和场转化凝胶电泳（FIGE），我们验证了克隆在BAC中的整个基因组的存在。通过在适当的分子量标准下，在无溴乙锭的1％琼脂糖凝胶上4.5V/cm电泳180分钟，通过电泳分离超螺旋DNA，进一步可视化整个克隆的基因组。

结论

BioXp™3200系统和工具使我们能够构建SARS-CoV-2的整个基因组，从设计到最终组装。

使用Codex专有的设计工具创建了构建SARS-CoV-2基因组所必需的三级程序集的计算机硅制图。具体来说，我们将SARS-CoV-2的整个〜30 kb基因组分为了第一阶段分子（24 X〜1.4 kb）二十四个部分。我们通过BioXp™套件订购门户订购了具有独特末端的这些零件。交付后，我们将试剂加载到BioXp™系统上并执行运行。经过16小时的运行，成功生成了包含SARS-CoV-2基因组的所有24dsDNA片段。我们使用GibsonAssembly^®方法克隆了片段，并使用Sanger测序分离了无错误的克隆。

通过GibsonAssembly^®方法将三个连续的I期克隆合并为II期分子（〜5.3 kb），然后进行PCR扩增和大小选择。我们使用GibsonAssembly^®方法将由此获得的六个II期分子组装成BAC。接下来，我们使用菌落PCR筛选了96个菌落，并验证了III期组装基因组中II期分子的存在。然后，我们通过菌落PCR选择了24个阳性鉴定的克隆。我们从中提取了SARS-CoV-2BAC，并使用限制酶消化从BAC中释放了基因组。使用FIGE分析释放的片段。我们测试的所有24个菌落均带有〜30 kb插入片段，表明SARS-CoV-2基因组的存在。我们对其中的几个菌落进行了超级螺旋DNA分析，从而可以可视化以环形分子形式克隆到BAC中的SARS-CoV-2基因组。所有测试的菌落均经过验证以包含全长基因组（图4）。

总结

以前，食品法典委员会的科学家开发并部署了合成DNA技术，以通过产生菌株特异性抗原部分来应对流感的年度威胁^[9]。SARS-CoV-2基因组变体的新威胁将触发合成生物学的类似用途，以合成抗原的多种菌株特异性变体，例如刺突蛋白。BioXp™3200系统和工具是一种破坏性技术，可加快发现疫苗，诊断方法和治疗方法的速度。BioXp™3200系统具有高度精确的合成dsDNA分子的能力，并能够实现快速的设计和合成迭代循环，它将扩展研究人员针对人类，牲畜和植物的其他传染原的发现能力。

参考文献

[1]https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/
[2] et. al. Direct RNA sequencing and early evolution of SARSCoV-2. bioRXiv 2020 doi:https://doi.org/10.1101/2020.03.05.976167
[3] https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019

[4] VAN Ｒ M，MAYO M，FAUQUET C，et al． Virus nomenclature: consensus versus chaos ［J］． Arch Virol，2000，145:2227－2232．

[5] SCHOEMAN D，FIELDING B C． Coronavirus envelope protein: current knowledge

[6] LU Ｒ J，XIANG Z，JUAN L，et al． Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implicationsfor virus origins and receptor binding ［J / OL］． Lancet，2020，https: ∥doi. org / 10. 1016 / S0140－6736 ( 20) 30251－8．

[7] NING D，XUE M Y，LIAN W Y，et al． Genomic and protein structure modelling analysis depicts the origin and infectiv-ity of 2019-n Co V，a new coronavirus which caused a pneumonia outbreak in Wuhan，China ［J / OL］． Biorxiv，2020，https: ∥doi． org / 10． 1101 / 2020. 01. 20. 913368．

[8] 吴雅玲[1]，陈骐[2]，王德民[3].SAＲS-Co V-2 和新型冠状病毒肺炎:发病机制与药物开发研究进展.福建师范大学学报 ( 自然科学版). 1000-5277( 2020) 05-0102-15

[9] Dormitzer et. al. Synthetic generation of influenza vaccine viruses for rapid response to pandemics. Sci Transl Med. 2013 May 15;5(185):185ra68. doi: 10.1126/scitranslmed.3006368

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周锦帆