实验室分析仪器--液相色谱分离条件中的化学键合固定相
化学键合固定相
将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗,并且可以通过改变键合相有机官能团的类型来改变分离的选择性。
1、键合相的性质
固定相又分为两类,一类是使用最多的微粒硅胶,另一类是使用较少的高分子微球。后者的优点是强度大,呈化学惰性,使用pH范围大,pH=1～14;缺点是柱效较小。常用于离子交换色谱和凝胶色谱。
目前,化学键合相广泛采用微粒多孔硅胶为基体,用烷烃二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶表面的游离硅醇基反应,形成 Si—O—Si—C 键形的单分子膜而制得。硅胶表面的硅醇基密度约为5个/nm2,由于空间位阻效应(不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上)和其他因素的影响,使得40%～50%的硅醇基未反应。残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响,特别是对非极性键合相,它可以减小键合相表面的疏水性,对极性溶质(特别是碱性化合物)产生次级化学吸附,从而使保留机制复杂化(使溶质在两相间的平衡速率减慢,降低了键合相填料的稳定性,导致碱性组分的峰形拖尾)。为尽量减少残余硅醇基,一般在键合反应后,要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理,即封端(又称封尾、封顶,end-capping),以提高键合相的稳定性。
由于不同生产厂家所用的硅胶、硅烷化试剂和反应条件不同,因此具有相同键合基团的键合相,其表面有机官能团的键合量往往差别很大,使其产品性能有很大的不同。键合相的键合量常用含碳量(%)来表示,也可以用覆盖度来表示。覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。
pH 值对以硅胶为基质的键合相的稳定性有很大的影响,一般来说,硅胶键合相应在pH=2～8的介质中使用。若过碱(pH>8),硅胶会粉碎或溶解;若过酸(pH<2),键合相的化学键会断裂。
最常用的“万能柱”填料为“C18”,即十八烷基硅烷键合硅胶填料(octadecylsilyl,ODS)。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用,它可完成高效液相色谱70%～80%的分析任务。由于 C18 是长链烷基键合相,有较高的碳含量和更好的疏水性,对各种类型的生物大分子有更强的适应能力,因此在生物化学分析工作中应用得最为广泛。近年来,为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务,又发展了 CH、C3、C4 等短链烷基键合相和大孔硅胶(20～40μm)。
2、键合相的种类
化学键合相按键合官能团的极性分为极性键合相和非极性键合相两种。
常用的极性键合相主要有氰基(—CN)、氨基(—NH2)和二醇基(DIOL)键合相。极性键合相常用于正相色谱,混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用,极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。
常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1～C18)和苯基、苯甲基等,以 C18 应用最广。非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离选择性都有影响,一般来说,样品容量随烷基链长的增加而增大,且长链烷基可使溶质的保留值增大,并可改善分离的选择性;但短链烷基键合相具有较高的覆盖度,分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。另外,C18 柱的稳定性较高,这是由于长的烷基链保护了硅胶基质的缘故,但 C18 基团的空间体积较大,使有效孔径变小,分离大分子化合物时柱效较低。
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