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生化应用小常识

2021.5.15

何谓生化检测的基质效应？怎样评估基质效应？该如何避免基质效应的发生？

临床生物化学分析中基质效应，已日益受到重视。最早是在酶活力测定中用人工制备的参考物质时发现。在酶法分析与免疫化学分析中，普遍存在的基质效应影响了定量测定的准确性。按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）文件的定义，“基质效应”（matrixeffect）是指：①标本中除分析物以外的其它成分对分析物测定值的影响；②基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义来说，基质效应也应包括已知的干扰物（胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等干扰物），但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素（如粘度、pH等）的影响。基质效应所致分析结果的偏差称为基质偏差（matrix bias）。用作校准物质或质控物，经过处理的混合血清，由于血清机制的理化性质在处理过程中的改变，在常规测定上往往出现基质偏差。基质偏差的出现也与分析系统（包括方法、试剂及所用仪器设备）有关，所以有人将基质效应定性为方法、材料与基质的特异性反应。在基质效应的评估方法方面，通常认为测定新鲜（或冰冻）血清无基质效应，决定性方法或参考方法也无基质效应。参考访法与常规方法测定同一批新鲜血清的结果一致，表示这项常规方法没有方法误差，如有差异则代表常规方法的“校准偏差”（calibration bias）。用参考方法与常规方法测制备物（如室间质评样品）时往往得不一致结果，这种差异称作调查偏差（survey bias）。调查偏差与校准偏差之差即基质偏差。减少基质效应的主要措施包括：

1、改进室间质评样品，使其作用更像新鲜人血清；

2、改进仪器设计及试剂组成；

3、选择方法及方法学参数，使其适应性更强，且容易掌握，对制备物（校准物、室间质评样品与质控物）基质的确切性质不敏感。王达二、目前国际上公认的测定葡萄糖参考方法是什么？与其它常用检测方法比较，有何优越性？目前国际上公认的测定葡萄糖参考方法是己糖激酶-UV法（HK-UV法），其测定原理是：标本中的葡萄糖在ATP的存在下，由己糖激酶的作用生成6-磷酸葡萄糖（G-6-P），G-6-P又在6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PDH）的作用下，并且在氧化型（NADP）的存在下，转变成6-磷酸葡萄糖酸，此时在波长330~350nm（或采用主波长330~350nm，副波长405~800nm的双波长测定法）下测定生成的还原型（NADPH）的增加量，求出葡萄糖浓度。 [参考值] 血清：3.3~5.6 mmol/L（60~100 mg/dL）与常用的葡萄糖氧化酶法（GOD法）比较，其优越性主要表现在：葡萄糖氧化酶法（SOD法）特异性催化β-D-葡萄糖。而葡萄糖α和β构型各占36%和64%，要使葡萄糖完全反应，必须使α-葡萄糖变旋为β-构型。国外某些商品试剂中含有变旋酶，可加速变旋过程。也可通过延长孵育时间，自发性变旋完成转化。结果的准确性必然受到影响。 SOD法中，第二步过氧化物酶反应特异性低，一些还原性物质，如尿酸、维生素C、胆红素、血红蛋白、四环素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争H2O2 ，从而消耗反应过程中所产生的H2O2，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。己糖激酶法是目前国际上公认的测定葡萄糖参考方法，该法通常用终点法测定，反应迅速，适合于各种生化分析仪。己糖激酶法基本不受溶血、脂血、黄疸、尿酸、维生素C及药物的干扰，其准确度和精密度相对较高。三、血清碱性磷酸酶（ALP）测定的常用方法有几种，它们之间有何差别？正常成人血清ALP主要来自肝脏，而来自骨组织的ALP一般少于总活性一半。其各自含量与年龄密切相关，但也受性别的影响。还可能存在少量的小肠型ALP，特别是血型为分泌型B型或O型的人。现已知人体含4型ALP同工酶，即肠型（IALP）、胎盘型（PALP）、生殖细胞型（GALP）和非特异组织型（TUALP）ALP。其中非特异组织型碱性磷酸酶在基因表达后经过不同的修饰形成肝、肾、骨等次级同工酶。 [临床意义] 肝胆疾病，尤其是阻塞性黄疸患者，该酶活性显著升高。骨骼疾病时血清ALP活性增高。血清ALP活性测定成为鉴别肝胆疾病和诊断骨质增生不可缺少的指标。 [测定原理] 在碱性条件下，碱性磷酸酶将无色磷酸对硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在 405nm测定对硝基苯酚生成的速率，这个速率与血清中ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。 [常用测定方法] 测定ALP活性受到组织来源、底物类型、反应温度，特别是缓冲液种类的影响，目前，世界范围内生化试剂主要生产厂家，生产的ALP检测试剂盒的主要差异就在于所使用的缓冲液不同。常用的激活型缓冲液不仅起缓冲作用，并可作为磷酸的受体参与反应，因而能增进酶促反应的速率。激活型缓冲液中，二乙醇胺（DEA）的激活作用比2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）的激活作用更强。因此用不同缓冲液测定的ALP活性，其参考值不同。不少国家，包括我国，多采用AMP或DEA做缓冲液，但这两类物质不易提纯，前者常混有5-氨基-3-吖-2，2，5-三甲基乙醇，后者易含一乙醇胺，均对ALP有抑制作用。故日本学者建议采用2-乙氨基乙醇缓冲液，而德国学者建议使用甲基葡萄糖胺缓冲液，此类试剂纯度高，不含抑制ALP活性的物质，可不加螯合剂，其pK值高于DEA。根据所使用的激活型缓冲液不同，常用的检测方法主要有四种： IFCC推荐方法：AMP（2-氨基-2-甲基-1-丙醇）缓冲液正常参考范围：45~130 U/L，37℃ JSCC推荐方法：EAE（2-乙氨基乙醇）缓冲液正常参考范围：115~359 U/L，37℃ GSCC推荐方法：DEA（二乙醇胺）缓冲液正常参考范围：80~260 U/L，37℃ DSKG推荐方法（新GSCC方法）：MEG（N-甲基-D-葡萄糖胺）缓冲液正常参考范围：45~130 U/L，37℃ 注：作为IFCC推荐的方法，IFCC有关专家也在考虑，ALP测定时所使用的缓冲液是否应该更换。目前SYSMEX公司在国内销售的是采用JSCC推荐方法的检测试剂盒，而采用IFCC推荐方法的检测试剂盒正在办理注册证，近期也将上市。

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周锦帆