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液质联用法测定沉积物中有（无）色孔雀石绿的改进

2018.11.16

孔雀石綠（MG）是一种合成的工业染料[1]。由于其还具有有效杀灭真菌、寄生虫等病原微生物的作用，在水产养殖中曾被用来预防和治疗受精卵和成鱼的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等，以及用于活鱼运输、暂养和环境的消毒等[2]。然而，孔雀石绿在生物体内有大量蓄积时，表现出高毒、代谢周期长、“三致”等毒副作用，还对生物体的组织、生殖、免疫系统产生影响，尤其是其代谢产物无色孔雀石绿（LMG）毒性更大[3]。虽然孔雀石绿在水产养殖中的违禁使用情况越来越少，但由于其曾经被广泛应用，已对环境造成了严重的次生污染，经调查发现，MG和LMG主要存在于水体及表层沉积物中。目前，针对水体、沉积物环境中的痕量MG和LMG检测方法相对还不成熟，当前主要采用灵敏度较低的液相色谱法、超高效液相质谱联用法[4-6]。由于沉积物中富集多种有机质，分析易产生干扰，导致高效液相色谱法定性不准确。而高效液相色谱串联质谱法由于灵敏度高、选择性强，因此针对MG和LMG药物残留检测具有较强的优势。目前报道了采用高效液相色谱串联质谱法测定水或沉积物中MG和LMG残留[6]，但其前处理方法较繁琐，回收率低，不适合大批量样品、痕量分析的需要。本研究充分利用高效液相色谱串联质谱灵敏度高、选择性强的优点，选择乙腈、乙酸乙酯、按一定比例混合的乙腈和二氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷等多种试剂提取化合物，通过加标回收率实验对比，筛选出二氯甲烷作为水体及沉积物中的孔雀石绿及其代谢物的提取试剂效果最佳，改进后的方法高效、灵敏、定性定量准确，可为孔雀石绿污染来源排查及评价养殖环境提供可靠的检测手段。

1 实验部分

1.1 仪器设备

液质质联用仪（美国AB公司），天平（赛多利斯公司）；高速离心机（美国Sigma公司）；高速组织匀浆机（飞利浦公司转速10 000 r/min），MS1 Mini-shaker 涡轮振荡器（IKA 公司）；MiLLi-Q纯水器（MiLLipore 公司）；氮吹仪（Organomation Associates 公司）；旋转蒸发仪（BUCHI 公司）；移液器（艾本德公司）。

1.2 试剂与材料

有色孔雀石绿（MG）、无色孔雀石绿（LMG）、有色孔雀石绿-D5、无色孔雀石绿-D6标准品，纯度均≥98%（德国Dr 公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；二氯甲烷（色谱纯，美国FLuka 公司）；实验用水由MiLLipore纯水系统（美国MiLLipore公司）制备；乙酸铵（LC/MS 级）、乙酸（色谱纯）、甲酸（纯度>98%）均购自美国FLuka公司；N，N，N'，N'-四甲基对苯二胺（TMPD，生物试剂），浓盐酸（分析纯）；乙酸铵（色谱纯）；中性氧化铝柱。

1.3 溶液

1.3.1 2 mmoL/L乙酸铵缓冲溶液称取0.030 g无水乙酸铵溶解于适量水中，定容至500 mL，再加入0.5 mL甲酸。

1.3.2 TMPD溶液（1.0 g/L）称取50 mg TMPD 溶于50 mL甲醇中。

1.3.3 有色孔雀石绿草酸盐（MG）、无色孔雀石绿（LMG）及其内标标准储备液（100 μg/mL）准确称取适量的有色孔雀石绿、无色孔雀石绿及其内标标准品，分别用乙腈溶解并定容，-18 ℃避光保存，有效期1年。

1.3.4 混合标准及内标中间液（1.0 μg/mL）分别准确吸取1.00 mL有色孔雀石绿、无色孔雀石绿及其内标标准储备液于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，-18 ℃避光保存，有效期3个月。

1.3.5 混合标准使用液（0.10 μg/mL）准确吸取1.0 mL混合标准中间液于10.0 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，-18 ℃避光保存，有效期1个月。

1.3.6 混合内标标准使用液（0.10 μg/mL）准确吸取1.0 mL混合内标标准中间液于10.0 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，-18 ℃避光保存，有效期1个月。

1.3.7 混合标准工作液临用时准确吸取一定量的混合标准使用液，加入混合内标标准使用液20 μL，用乙腈和5 mmoL/L乙酸铵缓冲溶液（1：1，V/V）稀释定容至1 mL，标准曲线系列浓度分别为0.50、1.0、2.0、5.0、10、20 ng/mL。

1.4 沉积物的制备

将刚采的湿沉积物置于阴凉通风处风干，风干后再进行敲碎、研磨直至成粉状，密封于广口瓶中，4 ℃冰箱保存，待测。

1.5 色谱条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODS （75×2.1 mm， 2.2 μm）；色谱柱温度：30 ℃；样品盘温度：15 ℃；流动相A相：2 mmoL/L的乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）；流动相B项：乙腈（0.1%甲酸）；进样体积：5 μL；流速：0.25 mL/min，具体参数见表1。endprint

1.6 质谱条件

离子化模式：ESI源，正离子扫描；离子源温度：600 ℃；气帘气：20 psi；碰撞气（CAD）：中；离子化电压：5 000 v；雾化气：60 psi；辅助气：40 psi。

扫描模式：选择性离子扫描（MRM），母离子、子离子荷质比、锥孔电压和碰撞能量见表2。

1.7 前处理方法

水样：取1 000 mL水，分液漏斗中，加入40 μL内标混合液（0.1 μg/mL），加入300 μL三甲基戊二醇（TMPD）溶液，加入30 mL的二氯甲烷，振摇5 min，静置30 min，取下层二氯甲烷于鸡心瓶中，再加入30 mL二氯甲烷重复一次，将下层液合并于鸡心瓶中，旋转蒸发浓缩近干，残留物加入2.0 mL的乙腈-2 mmoL/L乙酸铵溶液（1∶1），涡旋振荡1 min，超声波振荡2 min，过0.22 μm白色微滤膜于进样瓶中，上机测定。

粉末沉积物：准确称取（5.0±0.01） g粉末状沉积物样品于50 mL聚乙烯离心管中，加入40 μL内标溶液（100 ng/mL），加入200 μL TMPD溶液，加入10 mL二氯甲烷，涡旋震荡2 min，超声萃取5 min，6 000 r/min离心5 min，取上清液于20 mL玻璃离心管中，再向离心管中加入10 mL二氯甲烷，重复上述操作，合并上清液于20 mL玻璃离心管中，氮气吹至近干，残留物加入2.0 mL的乙腈-2 mmoL/L乙酸铵溶液（1∶1），涡旋振荡1 min，超声波振荡2 min，过SHIMADZU-GL Ⅱ MCE 0.22 μm有机相滤膜后，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱及质谱条件的优化

在已有文献的研究基础上，无机相选择2.0 mmoL乙酸铵0.1%甲酸，分别选择乙腈、甲醇、乙腈（0.1%甲酸）、甲醇（0.1%甲酸）有机相，实验结果表明有机相为乙腈（0.1%甲酸）洗脱出峰效果最佳，这可能与梯度洗脱时甲酸浓度保持一致，离子化效果较好所致。

根据MG 和LMG 的化学性质，选择ESI 正离子模式。以浓度为50 ng/mL有（无）色孔雀石绿与氘代有（无）色孔雀石绿作为优化标液。首先通过Q1全扫描确定化合物母离子质荷比，再通过Q3子离子扫描确定定量和定性离子的质荷比，根据确定的母离子和子离子优化去簇电压和碰撞能量，最后优化离子源温度、电压等参数。

2.2 水及沉积物中孔雀石绿提取剂的优化

根据相关文献报道沉积物中提取目标化合物需加入一定量的TMPD作为抗氧化剂来提高样品中MG 和LMG 的回收率[6]。本实验沉积物中孔雀石绿的提取选择乙腈：二氯甲烷（15∶10）混合液、纯乙腈、二氯甲烷分别作为沉积物、水基质中孔雀石绿提取试剂，实验结果表明：乙腈∶二氯甲烷（15∶10）混合液提取时，离心后不分层，将全部提取液浓缩至干，定容，测定结果回收率低于70%，实验耗时长；纯乙腈提取，浓缩较耗时，回收率低于70%，稳定性差；二氯甲烷作为提取剂，再加入20 mL TMPD解吸附溶液，回收率80%以上，稳定性好，最终二氯甲烷作为沉积物、水中孔雀石绿提取试剂。

本实验水体中目标化合物的提取同理加入一定量的TMPD作为抗氧化剂来提高样品中MG 和LMG 的回收率，提取方式选择固相萃取柱富集和有机相（二氯甲烷、乙酸乙酯）富集两种方式对比实验，实验结果表明固相萃取柱富集要求水体较纯净，实验过程过柱速度较慢实验耗时较长，平均回收率60%～70%，有机相提取方式相对要求水体纯净程度较低，富集时间较短，两种试剂提取效果表明二氯甲烷明显优于乙酸乙酯，平均回收率大于70%，最终实验选择有机相提取方式，二氯甲烷作为提取水体中的目标化合物的提取试剂。

2.3 方法的标准曲线与准确度

内标法定量，MG和LMG两者质量浓度均在0.2～100 ng/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：MG y=0.334 x+0.015 8（r2=1.000），LMG y=0.618 x+0.007 83（r2=1.000），r2均大于0.999。回收率均大于80%，大大减少了基质效应或其他实验条件带来的偏差，采用向阴性样品中添加标准物质的方法，进一步考察方法的灵敏度。在方法规定的取样体積和定容体积下，按3倍信噪比计算得该方法在环境水样和底泥样品中的检出限（LOD）分别为0.2 ng/L和0.02 μg/kg，以信噪比S/N>10得其定量下限（LOQ）分别为0.4 ng/L和0.04 μg/kg。标准图见图1。

2.4 方法的回收率与精密度

采用空白加标的方式，在环境水样中分别添加2.0、10、25 ng/L，沉积物中MG 和LMG 分别添加0.20、2.0、10 μg/kg 3个浓度梯度，按照本方法处理后测定，回收率和相对标准偏差见表3。沉积物中有色孔雀石绿的平均回收率为82.9%～84.4%，RSD为1.4%～3.5%；沉积物无色孔雀石绿的平均回收率为78.9%～86.7%，RSD为0.8%～5.2%，沉积物中空白及加标图分别见图2、图3。水体中有色孔雀石绿的平均回收率为78.3%～86%，RSD为1.2%～2.6%；水体中无色孔雀石绿的平均回收率为81.5%～88.8%，RSD 为0.6%～3.3%。因此，MG和LMG在水产养殖环境水和沉积物中的加标回收率均能达到检测要求，说明本方法具有较高的准确性。同时，RSD均低于15%，表明结果在置信区间内，本方法具有较高的可靠性。

2.5 实际样品的测定

采用该方法测定天津津南区、西青区6家水产养殖场的养殖池塘水体和沉积物中有（无）色孔雀石绿的残留情况，结果表明：一家企业有无色孔雀石绿检出，水中无色孔雀石绿浓度为2.1～4.3 ng/L，沉积物中无色孔雀石绿的浓度为0.6～3.5 μg/kg，其他企业均未检出。经进一步调查，发现该养殖企业在几年前确曾采用过MG来防治和治疗水霉病，因此，该方法可用于水产养殖环境水体和底泥中MG 和LMG残留量的测定。

3 结论

本文通过优化液液萃取条件，改进了水产养殖环境水体和沉积物中有（无）色孔雀石绿残留的高灵敏分析和确证方法。结果表明，本方法在0.2～100 ng/mL 范围内呈现良好的线性关系，水体和沉积物中的检出限分别为0.2 ng/L 和0.02 μg/kg；相对标准偏差（RSD）均小于15%。该方法步骤简单、回收率高、精密度良好，可作为水体和沉积物中MG及其代谢物LMG残留的检测方法，并可为MG及LMG在水产品中的富集规律与养殖环境中MG及其代谢物LMG残留的相关性分析及毒理评价提供灵敏、准确的分析手段，为水产品中MG及LMG溯源和质量监督提供检测技术支持。

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周锦帆