实验室分析仪器--色谱仪色谱柱的使用介绍
若柱效不佳,将会浪费样品分析时间,问题排查时间,更是浪费宝贵样品。所以色谱柱的使用操作的规范性,直接决定UPLC的分析效率与数据可靠性。
首先,应与色谱柱的供应商沟通,充分了解色谱柱的性能,如反相柱、正相柱、氰基柱、亲水柱、离子交换柱等。
再次,建立色谱柱的管理SOP,在SOP中规定色谱柱的登记、启用、使用及报废记录,便于色谱柱整个生命周期的管理。
色谱柱的启用
色谱柱包装开启后一定要阅读说明书,关注说明书中的注意事项,如pH的适用范围、流动相中能否采用水、平衡时的流速,保留溶剂等。
对于正相色谱柱来说,最重点的是注意初始流速一定要小,一般0.2ml/min。
反相柱就比较麻烦一点了,先用小流速0.2ml/min的甲醇冲洗2小时,再用10%甲醇冲洗2小时,最后过渡到检品的流动相,流速由低逐步增加到目标流速。
柱子开始使用前,必须确认系统适用性测试是否满足要求,主要关注理论板数、分离度、拖尾因子等关键分离参数,验收合格后才能使用。
色谱柱的清洗和保存
正相色谱柱进样后一般无需刻意清洗,但是需要保存时,必须按照说明书要求选择溶剂,以免长时间引起固定相干涸。
反相色谱柱清洗过程:高水相等度洗脱保证缓冲盐冲洗干净后,梯度洗脱的方式过渡到纯有机相,等度洗脱10~30柱体积,柱温可适当提高2~5度,方法运行完及时关闭柱温。
对于亲水作用色谱柱:最后保存尽量避免使用纯有机相,应包含少量的水,比如95%的乙腈。
色谱柱的使用
使用色谱柱,应轻拿轻放,安装零死体积。
切忌由大流速变化引起的压力变化对色谱柱造成机械损伤,应使用逐渐提高流速的方法达到目标流速。
建立色谱柱的使用记录,记录中体现出理论板数、分离度拖尾因子、柱压、保留时间、流动相体系、保存溶剂等信息,一旦发现参数异常,以便展开调查,避免偏差发生。
色谱柱使用过程中,应关注其柱压、柱效,使用完毕后填写“色谱使用记录”。
色谱柱最好是专用,带保护柱。并且使用过缓冲盐的色谱柱最好不要用于新项目的方法开发。
低紫外区的检测,为了避免“鬼峰”的出现,可以使用捕集柱,色谱柱使用完毕后一定要按SOP及时清洗。
对于鬼峰捕集柱的使用,很多科研单位觉得不可行,不知道如何在标准中进行表达。其实在方法建立过程中,如果鬼峰无法避免,可以在“发展报告”中说明使用鬼峰捕集柱的理由,并在标准中如实描述,以便与厂家或是QC进行方法转移。
有关亲水性色谱柱,小编也有些提议:
以HILIK色谱柱为例,使用更少或是较弱的极性溶剂可以增加极性化合物的保留。
样品溶解的溶液尽可能接近流动相条件的初始条件,然而,极性大的分析物经常在有机溶液中存在溶解度较低的现象,可以先用水溶解样品,再用乙腈/水溶液进行稀释,需要平衡溶解度和峰形之间的关系,根据化合物性质,具体情况具体分析。
色谱柱的报废要素
1.色谱柱堵塞,压力升高1000psi。
2.色谱柱污染出现鬼峰、噪音增加、检测限增大时。
3.填料塌陷或污染引起色谱图前沿、拖尾、分叉时。
4.理论板数、分离度、拖尾因子按各检品质量标准规定执行,未规定的按各国药典通则规定执行,不符合上述规定时。
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