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液质联用技术快速识别广东土牛膝中的两种黄酮类成分

2018.11.14

　　广东土牛膝为菊科植物华泽兰Eupatorium chinense L.的干燥根，具有清热解毒，凉血利咽等功效，临床上用于白喉，咽喉肿痛，感冒高热，麻疹热毒，肺热咳嗽；外伤肿痛，毒蛇咬伤等，该药材标准收载于《广东省中药材标准》（第一册）中[1]。近年来，国内不少学者对其化学成分和药理作用进行深入研究[2]，发现其中有效成分主要为黄酮类成分，而目前广泛应用的高效液相色谱/电喷雾串联质谱联用技术（HPLC/ESI-MSn）对广东土牛膝中的成分分析研究鲜有报道。
　　1仪器与试药
　　1.1 仪器Agilent 1200高效液相色谱仪，Agilent ChemStation操作系统；Acquity Quattro premier XE超高效液相色谱质谱联用仪LC/ms/ms；EYELA旋转蒸发仪；KQ2200超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；色谱柱：Water BEH C18（50mm×2.1mm×1.7μm））。
　　1.2 试药广东土牛膝（产地：广东、广西，均购自东莞市中药饮片有限公司）；泽兰素对照品、12，13-二羟基泽兰素对照品（自制，由中山大学药学院徐新军教授提供）；正己烷（分析纯，广州化学试剂厂）、三氯甲烷（分析纯，广州化学试剂厂）、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）、乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；硅胶G（100~200目，青岛海洋化学试剂厂）、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶。
　　2方法与结果
　　2.1色谱条件以Water BEH C18（50mm×2.1mm×1.7μm）为固定相；以甲醇（A）-10mmol/L乙酸铵（B）为流动相梯度洗脱（见表1）；流速为0.25ml/min；柱温为30℃；进样量为10μL。
　　
　　2.2质谱条件扫描方式为负离子扫描；离子源为电喷雾离子源；检测方式：多反映监测（MRM），电离电压为3.5kV，源温：110℃，雾化温度：350℃，雾化气：800L/h，锥孔气：50L/h；各监测离子见表2。
　　2.3提取和纯化取干燥的广东土牛膝，粉碎成粗粉，取该粉末0.5g，置100mL锥形瓶中，加入甲醇25mL超声提取30min，过滤，滤液蒸干，残渣溶解于2mL70%甲醇中，加入预先处理好的Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱（直径1.5cm，高20cm）上，用150mL70%甲醇进行洗脱，收集后面100mL洗脱液，水浴蒸干，残渣溶解加5mL甲醇溶解，得到样品溶液。分别精密吸取对照品和样品溶液10μL注入HPLC系统，进行HPLC-ESI-MSn分析。
　　2.4结构鉴定以泽兰素和12,13-二羟基泽兰素为对照品，用HPLC-ESI-MSn在上述色谱条件下对广东土牛膝有效部位的化学成分进行定性分析，检测到与2种对照品保留时间一致的2种化合物（以下称化合物a和b）的准分子离子峰[M-H]，由准分子离子峰确定其相对分子质量，结合二、三级质谱的碎片信息，通过与泽兰素和12,13-二羟基泽兰素对照品的相关数据信息进行对照。结果表明，样品溶液准分子离子峰和碎片峰数据与两种对照品分别完全一致，即广东土牛膝中含有泽兰素和12,13-二羟基泽兰素两种黄酮类成分。结果见图1-4。
　　
　　
　　注：泽兰素和化合物a色谱图中，离子碎片流图173.1（上）、158.1（中）和总离子流图215.2（下）；12,13-二羟基泽兰素和化合物b色谱图中，离子碎片流图231.3（上）、216.2（中）和总离子流图249.2（下）
　　3讨论
　　现代药理学表明，广东土牛膝具有抗菌[3]、中和毒素和抗炎镇痛作用，与泽兰素和12，13-二羟基泽兰素的药理作用相同，因此，笔者认为该方法能很好地作为快速识别广东土牛膝中有效化学成分的手段。

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周锦帆