脲酶Km值的简易测定
步骤
1.脲酶的提取：称取大豆粉1克，加入30%的乙醇25mL，充分摇匀后，置于冰箱中过夜，次日用2000rpm离心3分钟，取上清液备用。
2.标准曲线的制作：按下表加入各种试剂
单位：mL
立即摇匀各管，于460nm下比色，1号管为参比。
3.酶促反应速度的测定：按下表操作
单位：mL
管号 | 尿素浓度 | 尿素加入量 | 磷酸缓冲液 | 保温时间 | 脲酶加入量 | 煮沸脲酶 | 保温时间 | 硫酸锌 | 蒸馏 氢氧 |
1 2 3 4 5 | 0.050 0.033 0.025 0.020 0.020 | 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 | 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 | 37度水浴保温5分钟 | 0.20 0.20 0.20 0.20 / | / / / / 0.20 | 37度水浴保温10分钟 | 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 | 3.0 0.5 3.0 0.5 3.0 0.5 3.0 0.5 3.0 0.5 |
摇匀，静置5分钟后，于3000rpm离心5分钟，取上清液，供下步使用。
单位：mL
迅速混匀，于460nm处测吸光度，5号为参比
4.从标准曲线方程中脲酶作用于不同浓度尿素生成碳酸铵的量，然后以取单位时间碳酸铵生成量的倒数即1/V为纵坐标，以对应的尿素浓度的倒数即1/[S]为横坐标，应用最小二乘法公式，求出方程，计算Km值。
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